http://www.openstarts.units.it:80/dspace/handle/10077/102 2013-05-20T01:50:37Z http://www.openstarts.units.it:80/dspace/handle/10077/8642 Title: Breast Cancer Biomarkers: from Identification to Application to FFPE tissues Authors: Pracella, Danae Abstract: Background: Breast carcinoma (BC) is the most common form of malignancy in women and the leading cause of cancer-related mortality among females internationally. BC includes a series of heterogeneous tumours with a great variability at histological level, biological level and clinical evolution. Because its complexity, BC treatment recommendations are continually changing with the new advances in this field. However there are still a significant number of patients with similar features that show distinct outcome. In order to detect the existing molecular differences and address patients to more personalized treatment, there is a need to find out new cancer biomarkers. Aim: The main goal of my PhD project is to investigate on the possibility of combining traditional clinical and pathological features with new candidate biomarkers for the prognostication of breast cancer. The first part concerns the prognostic role of molecular classification of primary tumours, according to luminal A, luminal B, HER-2+ and basal-like subtypes. In the second part, the prognostic value of nine candidate genes was investigated at mRNA level. The genes of interest belong to the RB pathway (CDK2, RB1), the RAS pathway (HER-2, PI3K, AKT1, AKT2, AKT3, RAF1) and cellular differentiation mechanism (CK8). Methods: This retrospective study comprises 305 BC patients, both lymph node negative (LN-) and lymph node positive (LN+). The molecular classification of primary tumours was performed by means of immunohistochemistry (IHC), using seven surrogate markers: ER, PR, HER-2, Ki67, CK8 and CK5/6, plus vimentin. Results of molecular classification were analysed with respect to morphologic and pathological features, and outcome. Moreover, the molecular characterization was also performed in a set of loco-regional metastatic lymph nodes, to compare the phenotype of primary tumour cells with their matched metastatic cells colonizing regional nodes. To the second purpose, gene’s expression was investigated in the entire cohort of primary tumours by means of real-time PCR, using the TaqMan chemistry. The expression of the nine genes was investigated in connection with the clinical-pathological factors, molecular classification and BC specific patient’s survival. Results: Regarding molecular classification of primary tumours, luminal A, luminal B, HER-2+ and basal-like accounted for 46%, 34%, 8% and 12% respectively. Luminal A tumours were mainly LN-, well differentiated and stage I, while luminal B and HER2+ showed higher tumour grade, nodal metastases as well as higher proliferation status and stage. Luminal A exhibited better survival in comparison to the other subtypes (p<0.001). HER2+ and basal-like showed a poorer outcome. Despite of the longer survival of patients with luminal tumours, they are the only one that underwent long-term recurrences. The molecular classification at the level of loco-regional metastasis, revealed that HER-2, Ki67, CK8 and vimentin positivity was significantly decreased with respect primary tumour, whereas CK5/6 positivity was increased. No significant differences for ER and PR positivity between primary and metastatic lesions were found. Regarding gene’s expression, we found a significant different distribution for all genes, except RAF-1, among LN- and LN+ groups. We also found specific pattern of genes’ expression among molecular classes for: CDK2, HER-2, PI3K, AKT2, AKT3 and CK8. Survival analysis revealed a significant and independent role on patient’s survival for one gene in luminal A tumours. Conclusions: We believe that the use of the traditional biomarkers ER, PR, HER-2 and Ki67 is essential for BC characterisation and prognostication in association with clinical pathological features. Nevertheless, we identified new molecular markers that could better distribute patients into more homogeneous subgroups of BC. Description: 2011/2012 Type: Tesi di dottorato; Doctoral Thesis 2013-04-22T00:00:00Z http://www.openstarts.units.it:80/dspace/handle/10077/8639 Title: Le MICI pediatriche: analisi cellulare con luce di sincrotrone. Dati preliminari. Authors: Lembo, Maria Abstract: Le Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (MICI) rappresentano un disordine cronico, idiopatico ad eziologia ancora non del tutto definita, che colpisce una o più parti dell’intestino. Le MICI sono le più importanti cause di patologia gastrointestinale nei bambini e negli adolescenti. Si distinguono due grandi quadri clinici: Malattia di Crohn (MC) e Rettocolite Ulcerosa (RCU), la cui diagnosi è generalmente basata su un insieme di evidenze cliniche, di laboratorio, radiologiche, endoscopiche ed istologiche. Al momento non esiste una cura definitiva per questa patologia. Negli anni le ricerche sono state concentrate sullo studio di farmaci che agissero sull’infiammazione in modo da migliorare la sintomatologia e restituire al paziente una qualità di vita accettabile. Dal punto di vista chirurgico recenti studi, attraverso l’analisi morfometrica e l’immunofluorescenza, hanno analizzato i cambiamenti cellulari dopo importanti resezioni intestinali, così come accade nelle MICI o nelle enterocoliti neonatali necrotizzanti (NEC). Questi studi hanno dimostrato un precoce adattamento delle cellule intestinali alle modificazioni indotte chirurgicamente che si manifesta in alcuni casi con una iperplasia dei villi digiunali ed una ipertrofia dei villi ileali nel tratto di resezione. Sulla base di queste considerazioni, scopo della ricerca è dimostrare l’evoluzione della proliferazione cellulare e dello stato infiammatorio delle cellule per comprendere quale sia la risposta cellulare alla chirurgia e quali siano eventuali possibilità di applicazione di farmaci o sostanze biologiche. Nel nostro studio sono stati analizzati con la luce di Sincrotrone, applicata sia attraverso la microtomografia che la microspectroscopia a raggi X, i reperti operatori di pazienti con MICI in cui è stato esaminato lo stato infiammatorio delle cellule. Sono state standardizzate le procedure di conservazione e preparazione dei campioni, che sono stati prelevati con il consenso parentale durante l’intervento chirurgico. L’obiettivo è stato quello di valutare le potenzialità delle analisi con luce di sincrotrone per la visualizzazione e la caratterizzazione delle cellule intestinali di ileo malato e sano in MC, identificando i procedimenti, i tempi, i risultati e quindi la fattibilità della ricerca, in modo da poter intraprendere in maniera adeguata e mirata gli esperimenti successivi. La radiazione di Sincrotrone applicata sia attraverso la microtomografia che la microspectrografia a raggi X, permette di utilizzare tecniche di imaging non disponibili con sorgenti convenzionali. Il materiale da analizzare è stato analizzato sia integralmente, in tutto il suo volume, sia sotto forma istologica e/o ulteriormente marcato con sostanze chimico-biologiche. Sul tessuto analizzato, ileo sano e patologico con MC, con la microspectroscopia è stata rilevata la distribuzione tramite mappatura di alcuni elementi chimici Na, Mg, C, O, N sulla area infiammatoria e la corrispondente microstruttura tissutale. La microtomografia ha evidenziato le aree di distribuzione della mucosa intestinale ove è presente la flogosi patologica. Gli esperimenti eseguiti sono dati preliminari sui quali lavorare per acquisire gli elementi di miglioramento delle tecniche di applicazione e raggiungere gli scopi della ricerca. Description: 2011/2012 Type: Tesi di dottorato; Doctoral Thesis 2013-04-22T00:00:00Z http://www.openstarts.units.it:80/dspace/handle/10077/8571 Title: Identificazione e analisi funzionale delle mutazioni rilevate nel gene ANKRD26 responsabili di una nuova forma di piastrinopenia ereditaria Authors: Gnan, Chiara Abstract: La Trombocitopenia 2, anche definita come ANKRD26-Related Disease (ANKRD26-RD), rientra fra le nuove forme di piastrinopenie ereditarie recentemente caratterizzate. Si tratta di una trombocitopenia non sindromica a trasmissione autosomica dominante causata da mutazione nel gene ANKRD26. Fra le diverse caratteristiche cliniche spicca un’aumentata incidenza di sviluppare leucemie fra i pazienti affetti. Data l’associazione con il cancro, si rileva la necessità da una parte di migliorare la diagnosi delle diverse forme per comprenderne il meccanismo patogenetico e dall’altra di caratterizzare il fenotipo clinico della malattia indagando sul ruolo delle mutazioni a carico di ANKRD26 nell’alterare la produzione di piastrine e nello sviluppo di neoplasie. Abbiamo, pertanto, analizzato ANKRD26 in una casistica di pazienti piastrinopenici privi di una diagnosi identificando diverse mutazioni in eterozigosi, tutte localizzate nella regione 5’ non tradotta del gene. I pazienti affetti presentano una piastrinopenia moderata; i sintomi più comuni sono petecchie, ecchimosi, epistassi e menorragia. È stata evidenziata una diminuzione degli alfa granuli e un aumento della trombopoietina sierica. Nel midollo è stata osservata un’importante dismegacariocitopoiesi. E’ emerso infine, dagli studi fin qui condotti, una correlazione tra ANKRD26-RD e la leucemia: infatti l’incidenza di sviluppare leucemia acuta, nei pazienti con ANKRD26-RD, è di 167 casi su 100000 un’incidenza più alta che nel resto della popolazione stimata fra i 3,4 e 6,6 casi su 100000 (National Cancer institute). Per quanto riguarda la ricerca volta a definire i meccanismi patogenetici della malattia, abbiamo ipotizzato che le mutazioni, vista la loro localizzazione in una regione regolatrice, alterassero i meccanismi di controllo dell’espressione di ANKRD26 durante la megacariocitopoiesi. Come primo passo, abbiamo eseguito un’analisi bioinformatica per ricercare eventuali fattori di trascrizioni che riconoscono la regione delle mutazioni. L’analisi ha evidenziato un sito di legame per il fattore RUNX1. Successivamente abbiamo eseguito dei saggi di luciferasi attraverso i quali abbiamo dimostrato come le mutazioni determinino un aumento statisticamente significativo dell’attività di luciferasi almeno in cellule megacarioblastiche, DAMI, che possono essere differenziate in megacariociti. Infine abbiamo confermato mediante saggi EMSA l’interazione della regione delle mutazioni con il fattore RUNX1 predetto dal programma bioinformatico. Per due mutazioni (c.-128G>A e c.-119C>A), inoltre, abbiamo individuato un altro fattore di trascrizione HMGA1a non predetto dall’analisi bioinformatica. Infine studi di espressione su CD34+ e CD41+ hanno mostrato che ANKRD26 è maggiormente espresso nelle cellule staminali CD34+ ed è meno espresso nei megacariociti CD41+, lasciandoci ipotizzare che durante il processo di differenziamento ci sia una riduzione dei livelli di espressione del gene. Tutti questi dati ci suggeriscono, quindi, che il 5’UTR sia coinvolto nelle regolazione di ANKRD26. Saranno avviate, pertanto, nuove indagini volte ad caratterizzare ulteriormente i meccanismi mediante i quali le mutazioni interferiscono con il controllo dell’espressione, permettendoci di comprendere l’eziopatogenesi e la caratterizzazione della ANKRD26-RD. Description: 2011/2012 Type: Tesi di dottorato; Doctoral Thesis 2013-04-09T00:00:00Z http://www.openstarts.units.it:80/dspace/handle/10077/8569 Title: Identificazione e caratterizzazione di una nuova sindrome da immunodeficienza primaria associata ad albinismo oculocutaneo Authors: Prandini, Alberto Abstract: La sindrome di Hermansky-Pudlak definisce un gruppo di immunodeficienze primarie rare caratterizzate da albinismo parziale, di tipo autosomico recessivo che si presentano con un quadro di infezioni ricorrenti e predisposizione ad emorragie. I geni causativi di queste patologie codificano proteine coinvolte nella biogenesi e nel trasporto di organelli intracellulari correlati a endosomi e lisosomi. Il caso giunto alla nostra attenzione presentava solo alcuni dei sintomi caratteristici di queste immunodeficienze. Escluse le malattie genetiche più note tramite sequenziamento diretto si è ricorso ad exome sequencing in modo da poter rilevare anche nuove variazioni non note. E' stata infatti riscontrata una mutazione in omozigosi sul gene PLDN (BLOC1S6), codificante una proteina chiamata Pallidina, una componente del complesso BLOC-1. La condizione risultante è stata identificata con il nome di “sindrome di Hermansky-Pudlak di tipo 9” (HPS-9). In questo studio dimostriamo che tale mutazione è associata alla patologia e che compromette la funzionalità del reparto immunitario sia citotossico (linfociti Natual Killer e CD8+) sia presentante l'antigene (cellule dendritiche). Description: 2011/2012 Type: Tesi di dottorato; Doctoral Thesis 2013-04-09T00:00:00Z