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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/3037

Title: Studio dell'azione immunosoppressiva di cellule stromali ottenute da cordone ombelicale
Other Titles: Immune properties of mesenchymal stem cells obtained from Wharton's jelly
Authors: Valencic, Erica
Supervisor/Tutor: Ventura, Alessandro
Tommasini, Alberto
Issue Date: 19-Jan-2009
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Le cellule stromali mesenchimali multipotenti, oggi meglio conosciute come cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state isolate per la prima volta dal midollo osseo di ratti e porcellini d’india da Freidenstein et al. e sono state inizialmente descritte come precursori di fibroblasti per la loro somiglianza morfologica a queste cellule. Una decina di anni dopo le MSC furono isolate anche dal midollo osseo umano. Queste cellule, in vitro, si comportano come cellule staminali: sono capaci di autorinnovarsi e differenziano in cellule tipiche della linea mesenchimale, ma non solo, negli ultimi anni è stata dimostrata anche la loro capacità di differenziare in cellule endoteliali e neuronali. Nel midollo osseo le MSC sono rare: rappresentano solo lo 0.001-0.01% delle cellule nucleate, ma sono poi state identificate anche in molti altri tessuti come quello adiposo e muscolare. Queste cellule vengono isolate sfruttando la loro proprietà di aderire alle superfici plastiche e possono essere facilmente espanse in coltura. Sono caratterizzate da una morfologia eterogenea. Si possono infatti distinguere principalmente due popolazioni: una più piccola simile ai fibroblasti e una con un citoplasma più abbondante di forma quadrata che viene per questo denominata a “fazzoletto”. L’immunofenotipo viene descritto come negativo ai marcatori emopoietici (CD14, CD34 e CD45), endoteliali (CD31), all’HLA di classe II e alle molecole costimolatorie (CD80, CD86), e positivo a CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 e HLA di classe I. Le MSC possiedono oltre alla capacità differenziativa un’altra importante proprietà: quella immunomodulatrice. Infatti, in vitro, sono capaci di sopprimere la proliferazione cellulare di linfociti attivati. Per questo motivo queste cellule sono considerate le candidate ideali per il trattamento della Graft Versus Host Disease (GVHD) resistente ai trattamenti steroidei. Sono già utilizzate in trials clinici nonostante ci siano ancora alcuni problemi sperimentali da risolvere. Il primo è ottenere, dopo espansione in vitro, un numero di MSC sufficiente per gli usi terapeutici. A questo scopo sono in studio fonti alternative al midollo osseo, quali il cordone ombelicale e il liquido amniotico. Infatti queste cellule vanno incontro dopo una trentina di raddoppiamenti al fenomeno chiamato senescenza replicativa che rallenta e blocca la loro espansione numerica. L’altro problema è trovare un sostituto al siero fetale bovino, fonte di fattori di crescita per l’espansione cellulare, il cui utilizzo viene messo in discussione per il potenziale rischio di trasmissione di infezioni virali e di prioni dagli animali all’uomo. Scopo di questo lavoro è stato quello di isolare le MSC dalla matrice del cordone ombelicale (gelatina di Wharton) e di studiare l’attività immunosoppressiva delle cellule ottenute. Il cordone ombelicale infatti è facilmente ottenibile e contiene cellule biologicamente più giovani di quelle ottenute dal midollo di donatori adulti; in questo senso dovrebbe essere più semplice la loro espansione in coltura. Inoltre abbiamo usato, in combinazione con il siero fetale bovino (FBS), un pool di liquidi follicolari ovarici (LF), ottenuti contestualmente al prelievo degli ovuli da follicoli ovarici di donne sottoposte a fecondazione assistita. In questo studio sono stati utilizzati solo cordoni ombelicali ottenuti in corso di parto cesareo. La gravidanza deve essere stata portata a termine normalmente e il bambino non deve presentare aneuploidie o altre patologie. La vena e le arterie vengono rimosse con un bisturi e il tessuto rimanente viene sminuzzato fino ad ottenere piccoli frammenti che vengono quindi trasferiti in una piastra da 6 pozzetti con del terreno; dopo circa una decina di giorni le prime cellule cominciano a migrare dal tessuto e ad aderire alla plastica. Vengono quindi staccate con tripsina quando raggiungono la confluenza e seminate nei due diversi terreni: quello addizionato di solo FBS e quello addizionato sia di FBS che di LF. Sulle cellule così ottenute è stata analizzata la curva di crescita dimostrando che è possibile ottenere grandi numeri di MSC (> 1x107) con entrambe le condizioni di coltura. L’immunofenotipo è stato analizzato con la citofluorimetria: le cellule sono caratterizzate da un’elevata espressione del CD29, CD73, e HLA di classe I e da un’espressione più variabile del CD105; mentre sono negative al CD34, CD14 e CD45. Non abbiamo rilevato una differenza significativa tra le due condizioni di coltura fatta eccezione per la presenza di una minor variabilità dei valori per le cellule coltivate in terreno contenente FBS e LF. Le cellule coltivate con entrambe le condizioni di coltura sono capaci di compiere il differenziamento in senso adipogenico quando mantenute in terreni con gli appropriati fattori di crescita. In presenza del liquido follicolare le cellule mostrano un maggior numero di vacuoli. Infine abbiamo valutato le capacità immunomodulanti delle cellule isolate. Le MSC coltivate con entrambi i supplementi hanno mostrato una rilevante capacità antiproliferativa, più evidente per le cellule vive rispetto a quelle sottoposte ad irradiazione. La soppressione richiede il contatto cellulare e, diversamente da quanto suggerito in altri lavori, non sembra mediata dalla produzione di HLA-G. Tra le citochine analizzate l’unica prodotta in quantità elevate dalle MSC è risultata l’IL-6. Resta da valutare se il contatto cellulare sia necessario per l’effettiva soppressione o solo per attivare nelle MSC meccanismi di produzione di mediatori solubili.
PhD cycle: XXI Ciclo
PhD programme: MEDICINA MATERNO-INFANTILE,PEDIATRIA D.SVILUPPO E DELL'EDUCAZIONE,PERINATOLOGIA
Description: 2007/2008
Keywords: cellule staminali mesenchimali
cordone ombelicale
Main language of document: it
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: MED/38 PEDIATRIA GENERALE E SPECIALISTICA
NBN: urn:nbn:it:units-7356
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