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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/3047

Title: Applicazioni della glicobiologia all'imaging molecolare
Authors: Flamigni, Anna
Supervisor/Tutor: Paoletti, Sergio
Co-supervisor: Coslovi, Anna
Issue Date: 2-Mar-2009
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: I carboidrati sono stati per molto tempo considerati molecole aventi solo funzioni di tipo strutturale e di riserva energetica per la cellula e non sembravano in alcun modo coinvolti nei processi che contribuiscono allo sviluppo di una cellula completamente funzionante. Nuove ed accurate ricerche hanno dimostrato il ruolo svolto dai carboidrati in numerosi processi biologici al punto che attualmente essi sono considerati la terza categoria di macromolecole con caratteristiche bio-informative. I carboidrati sono strutture che possono dare una quantità di informazioni estremamente elevata; l’innumerevole variabilità dei legami con cui le unità monosaccaridiche possono costituire strutture più complesse, permette ai carboidrati di utilizzare un linguaggio estremamente eloquente. Questo linguaggio ha preso il nome di Glicocodice. I decifratori del glicocodice sono tipicamente proteine leganti gli zuccheri chiamate lectine, caratterizzate da un’elevata specificità; lectine in grado di riconoscere in modo specifico unità beta-galattosidiche, chiamate galectine, risultano coinvolte in numerosi processi che regolano l’omeostasi cellulare, tra cui le interazioni cellula-cellula, cellula-matrice, ma anche i sistemi apoptotici ed il differenziamento cellulare. Inoltre esse risultano strettamente correlate con lo sviluppo di numerose patologie tra cui i tumori e le infiammazioni articolari come l’osteartrite e l’artrite reumatoide. In particolare, la galectina-1, molecola regolatrice pro-apoptotica, risulta sovraespressa nei pazienti affetti da artrite reumatoide. Al contrario, l’aumentata espressione della galectina-3 risulta essere un fattore rilevante per lo sviluppo di patologie osteoartritiche. Le convenzionali metodologie di indagine diagnostica per immagine sono purtroppo strumenti deboli per l’analisi di patologie croniche, in particolare risulta difficile la distinzione tra stadio acuto e cronico e l’identificazione di fasi iperacute. E’ per questo motivo che è così complessa la distinzione tra l’artrite reumatoide e le altre patologie osteoarticolari nelle prime fasi della malattia. La messa a punto di metodologie in grado di fornire una diagnosi precoce e precisa è dunque uno dei passi fondamentali nella lotta all’artrite reumatoide. Oggi sono disponibili test di tipo immunologico a livello sierico e tecniche di imaging in grado di dare alcune informazioni importanti sulla natura e sul decorso della malattia. Tuttavia questi risultano essere strumenti ancora carenti per una diagnosi precoce della patologia. Nella moderna era della medicina molecolare, terapie geniche e terapie cellulari potranno essere studiate direttamente e indirettamente tramite l’uso dell’ imaging molecolare. L’utilizzo di tecniche di imaging funzionale e molecolare assieme a strumenti di immagine anatomica, può indubbiamente incrementare la specificità e la sensibilità della diagnosi. Le procedure di indagine molecolare dovrebbero essere dunque considerate importanti strumenti complementari alle tecniche di indagine per immagini utilizzate correntemente in clinica. Nuovi mezzi di contrasto per MRI in grado di interagire a livello molecolare potranno dunque incrementare il potenziale di questa tecnica. Inoltre, l’emergere di nuove tecniche di diagnostica per immagini che utilizzano metodi ottici (fluorescenza e bioluminescenza), che sono attualmente di comune utilizzo in modelli animali in fase pre-clinica, sono in corso di sviluppo per la loro applicazione anche sull’uomo. Il presente progetto di dottorato ha avuto come obiettivo la messa a punto di un sistema diagnostico per immagini che permetta di individuare precocemente e con alta specificità la presenza di patologie artritiche infiammatorie, in modo tale da diagnosticare la malattia artritica nei primi stadi del suo sviluppo, ma anche di discriminarne la tipologia e la prognosi, al fine di poter applicare una corretta e tempestiva strategia terapeutica. Per realizzare tale obiettivo, nel corso del dottorato di ricerca, sono state sviluppate strategie sintetiche di nuovi mezzi di contrasto in grado di individuare markers specifici della patologia artritica, successivamente utilizzati su modelli cellulari e animali. In particolare, come bersaglio per tali mezzi di contrasto sono state individuate le galectine. Per ottenere l’interazione con le galectine i nuovi mezzi di contrasto devono contenere sonde per la diagnostica per immagini coniugate con strutture opportunamente modificate con ramificazioni di galattosio, al fine di permettere il legame selettivo alle galectine ed indicarne la presenza. Il progetto è stato articolato in due parti: Parte A, Analisi delle Patologie Articolari a Livello Molecolare. In questa fase sono stati sintetizzati complessi polimerici che potrebbero aiutare la comprensione dello sviluppo delle patologie articolari a livello molecolare. In particolare è stata effettuata la clusterizzazione di unità galattosidiche, note sonde biologiche per le galectine. La scelta delle strategie sintetiche è stata effettuata a partire dalla conoscenza del biopolimero Chitlac, composto le cui caratteristiche chimico/fisiche erano già ben note nel nostro laboratorio e a cui sono state riconosciute capacità di influenzare la crescita dei condrociti. Per meglio comprendere le interazioni e gli effetti di tale polisaccaride con molecole biologiche e colture cellulari, sono stati effettuati studi a livello molecolare e in vitro. In primo luogo si è quindi determinata la costante di affinità del Chitlac per le galectine-1 e -3, successivamente sono stati condotti studi di internalizzazione del Chitlac da parte di cellule presentanti un elevato numero di recettori per il galattosio (cellule di epatocarcinoma) e di condrociti primari, oggetto principale della nostra ricerca. I risultati ottenuti, hanno permesso di stabilire che il polisaccaride viene internalizzato negli epatociti in misura maggiore e in condrociti, in misura inferiore. Ne è seguito uno studio sull’effetto che il Chiltac svolge sul ciclo cellulare di tali cellule. Il risultato ottenuto ci ha indotti a pensare che il Chitlac sia in grado di interferire con le strutture che regolano il ciclo cellulare presumibilmente interferendo proprio con le galectine, proteine che controllano a monte l’espressione di proteine regolatrici dei checkpoint del ciclo cellulare. Questi risultati potrebbero finanche suggerire l’utilizzo del Chitlac non solo come sonda diagnostica ma anche some possibile agente terapeutico. Parte B, Analisi delle Patologie Artritiche a Livello Tissutale. Unità galattosidiche sono state ancorate a sonde per MRI, tra cui il DTPAGd (Magnevist®) presente in commercio e comunemente utilizzato in clinica, al fine di ottenere sonde maggiormente selettive nei confronti di patologie presentanti alterazioni dell’espressione di lectine. Come atteso, l’aggiunta dei gruppi ossidrilici dello zucchero ha portato ad un aumento dell’indice di relassività rispetto alla sonda commerciale con conseguente miglioramento dell’immagine MRI ottenuta dopo l’iniezione endovenosa del complesso di gadolinio. Infine, il Chitlac è stato utilizzato per evidenziare patologie artritiche in modelli animali tramite l’utilizzo dell’imaging ottico. A tale scopo, il polimero è stato coniugato con la sonda fluorescente Cy5.5. Le iniezioni intra-articolari del polimero hanno evidenziato le sole articolazioni patologiche, mentre il Chitlac è stato rapidamente allontanato dalle articolazioni sane. Una prima prova per via endovenosa ha inoltre permesso di verificare la permanenza nell’articolazione del polimero che dunque appare non subire un significativo sequestro da parte del fegato, come poteva essere ipotizzabile dai risultati ottenuti in vitro. Dagli studi condotti nel corso del presente progetto di tesi, è possibile concludere che la clusterizzazione del galattosio induce un incremento dell’affinità nei confronti delle galectine-1 e -3. Inoltre il polimero Chitlac (chitosano lattosilato) si è dimostrato in grado di interagire a livello cellulare al punto da influenzare il ciclo cellulare. Ulteriori studi potrebbero permettere una migliore comprensione di tali eventi. Infine, la possibilità di studiare condrociti derivanti da tessuti di articolazioni patologiche potrebbe permettere di valutare se in tali condizioni l’alterazione dell’espressione delle galectine possa essere tale da aumentare l’internalizzazione del polimero nelle cellule malate ed i suoi effetti sul ciclo cellulare. Studi preliminari in vivo su modelli di animale artritici, hanno permesso di evidenziare la permanenza del Chitlac nella articolazioni degli animali patologici, diversamente dagli animali sani, suggerendo un potenziale uso del polisaccaride nella discriminazione delle due tipologie di articolazione, effetto non evidenziabile con l’utilizzo di due polisaccaridi di controllo (chitosano e destrano), cioè privi del sostituente galattosio.
PhD cycle: XXI Ciclo
PhD programme: SCIENZE BIOMOLECOLARI
Description: 2007/2008
Keywords: glicobiologia
diagnostica
imaging
cartilagine
artrite
galectine
polisaccaridi
Main language of document: it
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/10 BIOCHIMICA
NBN: urn:nbn:it:units-7380
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