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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/3074

Title: Insight into the temporial evolution of spontaneous Ca2+ signals generated by ventral neurons during spinal cord maturation in vitro
Authors: Sibilla, Sara
Supervisor/Tutor: Ballerini, Laura
Issue Date: 27-Mar-2009
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Nel midollo spinale lo sviluppo in circuiti funzionali delle reti neuronali dell’area ventrale è un processo complesso, che coinvolge meccanismi genetici ed epigenetici che promuovono la maturazione del controllo motorio (Jessell, 2000; Kiehn, 2006). Far luce su tali meccanismi è un passo cruciale per identificare quei neuroni che risultano essere più vulnerabili in caso di patologie degenerative del midollo spinale, ma anche per elaborare nuove strategie nel campo della rigenerazione dei circuiti danneggiati. Le colture organotipiche ottenute dal midollo spinale embrionale di topo e mantenute in vitro per 1 o 2 settimane, riepilogano molti dei processi che caratterizzano lo sviluppo dei segmenti spinali in vivo e sono particolarmente adatte allo studio della maturazione della rete spinale (Avossa et al., 2003; Rosato-Siri et al., 2004; Furlan et al., 2005; Furlan et al., 2007). In questa tesi ho usato tale modello per studiare, nei segmenti di midollo spinale embrionale, il controllo spazio-temporale di segnali intracellulari al Ca2+, generati da popolazioni neuronali appartenenti ai circuiti motori. Ho osservato la presenza di segnali ripetuti al Ca2+ dipendenti dall’età delle colture, monitorando le dinamiche intracellulari del Ca2+ nelle singole cellule con esperimenti di Ca2+-imaging in fettine precedentemente incubate con la sonda fluorescente FURA2-AM. Ho analizzato piccoli gruppi di interneuroni localizzati nella regione ventrale del midollo spinale, a stadi sia precoci che tardivi di sviluppo della rete, cioè a 7-11 (prima settimana) e 14-17 (seconda settimana) giorni in vitro (DIV; Furlan et al., 2007). Per la prima volta ho descritto un cambiamento nella generazione di segnali spontanei al Ca2+, dipendente dalla maturazione in vitro delle colture: da waves precoci, guidate dall’attività sinaptica, che invadevano l’intera regione ventrale del midollo spinale, fino a tardive oscillazioni asincrone, indipendenti dall’attività elettrica, generate da pochi neuroni ristretti alle aree ventrali. Mediante marcature di immunofluorescenza nonché con esperimenti di Ca2+- imaging, ho dimostrato che solo una minoranza (dal 15 al 20 %) di neuroni presenti nelle zone ventrali esprimevano questa tardiva attività oscillatoria. Queste oscillazioni mostravano una specifica dipendenza dalle proprietà di buffering del Ca2+ presenti a livello mitocondriale (Fabbro et al., 2007). In seguito, ho valutato il ruolo che le fonti extracellulari e intracellulari di Ca2+ potevano avere nella generazione di queste oscillazioni indipendenti dall’attività elettrica. Una prima idea del fatto che tali oscillazioni avessero un’origine complessa, Abstract 6 derivava dall’osservazione che nella maggior parte delle cellule (60%), questi segnali erano completamente bloccati in una soluzione priva di Ca2+, mentre nel 40% dei neuroni alcune oscillazioni persistevano anche in assenza di Ca2+. Questa risposta in una soluzione priva di Ca2+ è risultata essere bimodale, dal momento che non ho mai riscontrato alcuna coesistenza di questi due fenomeni nella stessa fettina. Una simile eterogeneità è stata osservata anche in seguito ad applicazioni di tapsigargina, la quale induceva sia il blocco (62% di neuroni) che la persistenza (38%) delle oscillazioni. Questa attività oscillatoria non dipendeva, però, dai depositi intracellulari di Ca2+ sensibili alla rianodina. Così, nonostante le proprietà stereotipate delle oscillazioni (origine, periodicità, etc…), questi eventi potrebbero essere generati grazie al contributo di diverse fonti di Ca2+. Una seconda questione importante nell’identificazione dei neuroni oscillanti è stata quella di monitorare i pattern di espressione delle Ca2+ binding proteins e dei trasportatori del Cl-, KCC2 e NKCC1. Ho osservato una forte dipendenza del profilo di espressione della proteina calbindina in relazione alla maturazione dei circuiti ventrali durante lo sviluppo. Questo non era, però, un fenomeno universale, infatti, altre Ca2+ binding proteins, come calretinina e parvalbumina, non avevano lo stesso profilo di espressione. Non ho, invece, riscontrato differenze nell’espressione della proteina NKCC1 tra 1 e 2 settimane in coltura; al contrario KCC2, andando avanti con lo sviluppo, si trovava maggiormente localizzata nei processi neuronali. Risultati recenti dimostrano che l’H2O2 è un donatore endogeno di specie reattive dell’ossigeno, presente nel CNS in concentrazioni μM (Lei et al., 1998). Nel midollo spinale post-natale l’H2O2 è stata recentemente indicata anche come un mediatore solubile dipendente dal Ca2+ intracellulare, capace di modulare la plasticità sinaptica in condizioni sia fisiologiche che patologiche (Takahashi et al., 2007). In questo mio studio, concentrazioni fisiologiche di H2O2 aumentavano il livello basale del Ca2+ intracellulare solo nei neuroni che oscillavano, senza però cambiare il periodo delle oscillazioni. Il fatto che i neuroni oscillanti fossero le sole cellule che rispondevano a basse dosi di H2O2 ci ha suggerito che questi interneuroni spinali potrebbero essere dei critici trasduttori dell’azione modulatoria dell’H2O2. In questo modo, un piccolo gruppo di interneuroni ventrali (a 2 settimane di crescita in vitro) potrebbe essere caratterizzato da due marcatori funzionali: la sensibilità all’ H2O2 e la capacità di produrre oscillazioni spontanee. Sembra molto interessante supporre che le periodiche oscillazioni al Ca2+ e la sensibilità all’H2O2 conferiscano a queste cellule la capacità di modellare la plasticità dei circuiti locali attraverso differenti cambiamenti (fasici o tonici) nella concentrazione del Ca2+ intracellulare.
The development of ventral spinal networks into functional circuits is a complex process comprising genetic and epigenetic mechanisms cooperating for the maturation of motor control (Jessell, 2000; Kiehn, 2006). Elucidating such a process is crucial in modern neuroscience to identify neurons more vulnerable to spinal degenerative disease or to develop novel strategies for rebuilding damaged circuits. Organotypic cultures developed from embryonic mouse spinal cord, maintained in vitro for 1 or 2 weeks, recapitulate many events of the in vivo developing spinal segments and are particularly suited to study spinal network maturation (Avossa et al., 2003; Rosato-Siri et al., 2004; Furlan et al., 2005; Furlan et al., 2007). In this thesis, I used such a model to investigate, in embryonic spinal segments, the spatio-temporal control of intracellular Ca2+ signaling generated by neuronal populations in motor circuits. I investigated the age-dependent expression of repetitive Ca2+ signals monitoring, by Ca2+-imaging technique, neuronal Ca2+ dynamics at single cell level in slice cultures of the embryonic mouse spinal cord, loaded with the fluorescent indicator FURA2-AM. I analyzed small groups of ventral spinal neurons at early and late embryonic network developmental stages, namely at 7-11 (1 week) and 14-17 (2 weeks) days in vitro (DIV; Furlan et al., 2007). I reported, for the first time, the developmentally-regulated shift in the generation of repetitive Ca2+ signals, from early waves driven by synaptic activity invading the entire spinal region to late, activity-independent, asynchronous oscillations generated by few neurons in restricted ventral areas. I demonstrated by immunofluorescence stainings and Ca2+-imaging experiments, that only a minority (15 to 20 %) of ventral neurons expressed this late Ca2+ oscillatory activity. Such oscillations expressed a specific dependence on mitochondria Ca2+ buffering properties (Fabbro et al., 2007). Next, I addressed the role of the extracellular and intracellular Ca2+ sources in the generation of activity independent oscillations. A first glimpse about the complex origin of Ca2+ for oscillations came from the observation that, in the majority of cells (60%), oscillations were completely abolished by Ca2+-free solution, whereas in 40% of cells clusters of oscillations were still detected during Ca2+-free perfusion. This response to Ca2+-free medium was bimodal, as no coexistence of these two effects was found in the same slice. Similar heterogeneity was observed following the application of the Ca2+ stores depletory, thapsigargin that induced either block (62% of neurons) or persistence (38%) of oscillations. The oscillatory activity was not dependent on ryanodine-sensitive stores. Abstract 4 Thus, despite the stereotyped properties of oscillations (origin, periodicity, etc), these events could be generated with the contribution of multiple Ca2+ sources. A second issue relevant in identifying oscillating neurons was to monitor the patterns of expression of Ca2+ binding proteins and of Cl- co-transporters, KCC2 and NKCC1. I observed a strong dependence of the expression profile of the Ca2+-binding protein calbindin on developmental maturation. This was not an universal phenomenon, in fact, other Ca2+ binding proteins, such as calretinin and parvalbumin, did not follow the same pattern. I did not detect differences in the expression pattern of NKCC1, between 1 and 2 weeks of in vitro growth, conversely KCC2-ir was more located to neuronal processes along with development. Recent results show that H2O2 is an endogenous donor of reactive oxygen species present in the CNS in μM concentrations (Lei et al., 1998). In the postnatal spinal cord, H2O2 has been recently indicated as a soluble, Ca2+ dependent mediator, capable of modulating synaptic plasticity under physiological and pathological conditions (Takahashi et al., 2007). In this study, physiological concentrations of H2O2 increased intracellular Ca2+ only in oscillating neurons without changing the oscillation period. The fact that oscillating neurons were the only responsive cells to a low H2O2 dose suggested that these spinal interneurons could be critical transducers of the modulatory action of H2O2. Thus, a small group of ventral interneurons (at 2 weeks in vitro) could be characterized by two functional predictors, namely sensitivity to H2O2 and ability to produce spontaneous oscillations. It seems attractive to assume that periodic oscillations of Ca2+ plus H2O2 sensitivity confer a summative ability to these cells to shape the plasticity of local circuits through different changes (phasic or tonic) in intracellular Ca2+.
PhD cycle: XXI Ciclo
PhD programme: NEUROSCIENZE
Description: 2007/2008
Keywords: spinal cord
development
organotypic cultures
Ca2+ signalling
H2O2
Ca2+-imaging
Main language of document: en
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/09 FISIOLOGIA
NBN: urn:nbn:it:units-7403
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