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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/3612

Title: Libraries of short receptors peptides and antibodies for the recognition of small organic molecules
Authors: Fontanive, Giampaolo
Supervisor/Tutor: Berti, Federico
Issue Date: 26-Mar-2010
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: La presente tesi di Dottorato riporta i risultati di ricerche svolte nell’ambito di alcune collaborazioni tra Università ed industria nel campo della progettazione e sviluppo di librerie di trasduttori primari per biosensori. In particolare l’attenzione si è rivolta da un lato a piccoli peptidi come recettori di xanthine (caffeina e teofillina), dall’altro ad una molecola di grandi dimensioni, la palitossina, verso la quale al momento sono stati preparati anticorpi con tecniche più convenzionali. Il contributo di un chimico in questo tipo di progetti è analogo, e consiste in un’attività di sintesi di derivati modificati delle molecole di interesse, nella loro bioconiugazione a proteine ed enzimi, nella sintesi di peptidi, nello studio dell’interazione ligando-recettore attraverso misure di attività, analisi conformazionale e strutturale, modellizzazione. L’attività svolta è brevemente descritta nei punti seguenti. 1) I coiled-coil sono motivi strutturali presenti in natura dati dall’unione di due o più -eliche avvolte su loro stesse al fine di generare un’unica super-elica. L’analisi di tali strutture rivela spesso la presenza di sequenze ripetute di 7 amminoacidi ripetuti (g-a-b-c-d-e-f) con precise caratteristiche: la posizioni a e d per esempio sono occupate sempre da amminoacidi con caratteristiche idrofobiche, atti a generare una interfaccia idrofobica interna alla super-elica molto stabile e non esposta al solvente esterno. Parallelamente, le posizioni e e g sono invece occupate da amminoacidi polari carichi che si trovano sulla superficie esterna della super-elica e possono iteragire tra di loro rinforzando l’interazione e provocando effetti di orientamento. La nostra attenzione si è focalizzata sul coiled-coil denominato EK, sviluppato agli inizi degli anni ’90 da Hodges e colleghi. In questa struttura due catene peptidiche denominate appunto E e K si avvolgono su loro stesse al fine di generare una super-elica anfipatica di notevole stabilità.Partendo da tale struttura e sfruttando la tecnica biomolecolare del phage display che permette l’esposizione di strutture a carattere proteico sulla superficie di un batteriofago, sono state create librerie di EK mutati con l’obiettivo di generare all’interno della super-elica siti recettoriali eventualmente utilizzabili all’interno di biosensori come trasduttori primari per caffeina e teofillina, due piccole molecole organiche altamente correlate e ampiamente presenti nella vita quotidiana. E’ stata prodotta una prima libreria fagica di dimensioni notevoli (108 elementi), all’interno della quale sono stai isolati due cloni specifici per le xanthine; i due cloni sono stati denominati E1 ed E8. La caratterizzazione del binding è avvenuta sia con tecniche biomolecolari che prevedono l’immobilizzazione dell’analita su superficie solida (test ELISA e dot-blot), sia con teniche chimiche con analiti liberi e privi di modificazioni strutturali. Al fine di ridurre il più possibile le dimensioni dello scaffold di partenza è stata sviluppata una seconda libreria fagica in cui è stata randomizzata soltanto la catena K dell’originario EK proposto da Hodges. La libreria finale presenta una dimensione di 108 elementi, tra i quali è stato isolato e caratterizzato attraverso test ELISA il clone denominato KE1. Le ridotte dimensioni di tale peptide (35 amminoacidi) hanno permesso la sua sintesi chimica su una buona scala (40 mg), una cartterizzazione strutturale attraverso spettroscopia di dicroismo circolare, un’analisi dell’interazione in soluzione con la teofillina sfruttando sempre la tecnica CD e quella calorimetrica ed infine un’analisi cristallografica attraverso luce di sincrotrone. 2) Una seconda parte del lavoro è stata finalizzata, invece, allo sviluppo di pool anticorpali mono- e policlonali quali trasduttori primari in biosensori per l’individuazione della palitossina. Tale tossina algale con elevato indice di pericolosità (LD50=0.45 g/kg) negli ultimi anni ha causato notevoli disagi in campo ambientale, inquinando flora e fauna acquatica di diverse zone marittime, compreso il Mediterraneo e l’alto Adriatico. Per lo sviluppo di anticorpi specifici contro tale tossina, sono state condotte immunizzazioni su coniglio e su topo con palitossina coniugata a due tipi di proteine carrier (BSA e KLH) al fine di ridurre la sua tossicità e indurre una risposta immunitaria nell’animale. Il pool anticorpi policolnali di siero di coniglio è stato isolato e caratterizzato attraverso sandwich ELISA contro palitossina libera e palitossina chimicamente modificata allo scopo di ottimizzare tale tipo di test e utilizzarlo come possibile dosatore nei confronti dell’analita presente in campioni di acqua oppure in sistemi più complessi quali mitili o ulteriore fauna marina.
This PhD thesis reports the results of research activities carried out at the Dept. of Chemistry of the University of Trieste, in collaboration with several industries, in the field of design and development of libraries of primary transducers for biosensors. We have focused our attention on one side on short peptides as xanthine (caffeine and theophylline) receptors, and on the other side on a very large molecule, palytoxin, which has been considered to raise antibodies by more conventionals techniques. The chemist’s contribution to such projects is similar, consisting in the synthesis of modified target molecules, in their bioconjugation to protein and enzymes, in peptide synthesis, in studying the receptors-ligand interactions by affinity measurements, conformational and structural analysis, modelling. The activity is briefly described in the following points. 1) Coiled-coil are natural motifs made by bundles of two or more -helix that generate a super-helix. Structural analysis of these motifs reveals often the presence of a repeated sequence 7 aminoacids along the helix (g-a-b-c-d-e-f). a and d are hydrophobic aminoacids able to generate an internal hydrophobic core most important for the overall stabilization of the bundle, e and g are polar or charged aminoacids that can contribute to the final stability of the coil via electrostatic interchains interactions. Starting from the EK coiled-coil developed by Hodges et al., made by two different peptide chains (E:EVSALEK; K:KVSALKE) and exploiting phage display techniques, two different phage libraries of E and K mutants were generated, in order to obtain receptors molecules suitable as primary transducer in biosensors for caffeine and theophylline. In the first library, both E and K were randomized, obtaining 108 differents peptide clones; two specific clones was isolated against immobilized caffeine and theophylline, their characterization was carried out both by biomolecular experiments (ELISA test; dot-blot) and by chemical techniques. In a second library, we have further reduced the scaffold size, using only a single K chain. A new library of 108 elements was obtained and characterized. The isolation of KE1 clone as the best xanthine binder, allowed chemical synthesis on a good scale (40 mg); structural characterization and binding analysis of its interaction with theophylline in water was performed by circular dichroism and calorimtrey; the X-ray structure of the peptide was obtained exploiting sincrothrone light. 2) In a second part of this work, the development of mono- and polyclonal antibodies towards palytoxin was stated. Palytoxin is one of the most dangerous algal toxin in nature (LD50=0.4 g/kg in mice) and its presence in the last years in Mediterranean sea, both in the water sea and in fish or mussels, constitues a real problem for tourism economy and for the fish market. In order to obtain specific antibodies as bioreceptors towards palytoxin, a series of immunizations on rabbits were carried out with palytoxin-BSA and palytoxin.KLH conjuagtes in order to generate immune response in the animals; the pool of high reactivity bleeds of rabbits, were isolated and usedto set up ELISA sandwich system towards palytoxin.
PhD cycle: XXII Ciclo
PhD programme: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE E TECNOLOGIE CHIMICHE E FARMACEUTICHE
Description: 2008/2009
Keywords: Librerie di peptidi e anticorpi
Phage display
Sintesi e modificazioni di molecole organiche target
Bioconiugazione a proteine
Spettroscopia NMR e CD su biomolecole e bioconiugati
Main language of document: it
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: CHIM/06 CHIMICA ORGANICA
NBN: urn:nbn:it:units-8864
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