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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/3618

Title: Structure-function relationship of polysaccharides produced by opportunistic pathogens
Other Titles: Relazioni struttura-funzione di polisaccaridi prodotti da patogeni opportunisti
Authors: Foschiatti, Michela
Supervisor/Tutor: Rizzo, Roberto
Cescutti, Paola
Co-supervisor: Cescutti, Paola
Issue Date: 26-Apr-2010
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Argomento di questa tesi di dottorato sono i polisaccaridi (sia capsulari, CPSs, sia esopolisaccaridi, EPSs), prodotti da batteri e rilasciati nell’ambiente circostante, ed il loro ruolo nelle infezioni batteriche. Sono stati presi in considerazione batteri opportunisti responsabili di infezioni polmonari in pazienti affetti da fibrosi cistica (CF). I risultati riportati in questa tesi di dottorato comprendono diverse linee di ricerca e contribuiscono a chiarire le diverse caratteristiche chimiche e biologiche dei polisaccaridi batterici presi in considerazione. La prima linea di ricerca riguarda due EPSs strutturalmente simili prodotti da Inquilinus limosus, un batterio recentemente isolato dalle secrezioni polmonari di pazienti con CF. Si è voluto valutare se i due EPSs fossero in grado di assumere conformazioni differenti e quindi ipoteticamente producessero diverse attività biologiche. Le proprietà conformazionali sono state valutate mediante misure di dicroismo circolare ed immagini ottenute mediante microscopia a forza atomica. Studi di modellistica molecolare sono stati effettuati dalla Dr.ssa M. Kuttel (Dip. di Chimica, Univ. di Cape Town). I due polimeri esibiscono effettivamente differenti conformazioni elicoidali (strutture secondarie), che vengono stabilizzate da legami idrogeno e caratterizzate dalla presenza di gruppi piruvato carichi esposti sulla superficie esterna dell’elica. Questo risultato conferma l’ipotesi che la biosintesi di più specie polisaccharidiche può risultare un mezzo utile per il batterio per diversificare i propri strumenti di difesa da possibili minacce esterne. La seconda linea di ricerca ha preso in considerazione l’esopolisaccaride cepaciano, prodotto dalla maggioranza dei ceppi appartenenti al complesso della Burkholderia cepacia (Bcc). L’unità ripetitiva (RU) di questo EPS è stata isolata dalla membrana interna batterica, dove si trova legata a un trasportatore lipidico prima della polimerizzazione. Durante il lavoro di questa tesi, è stato sviluppato un protocollo per isolare l’unità ripetitiva e la sua RU biologica è stata determinata mediante analisi ESI-MS. Questo studio, che nasce dalla collaborazione con la Dr.ssa C. Lagatolla (Dip. di Scienze della Vita, Univ. di Trieste), impegnata nella ricerca dei geni coinvolti nella biosintesi del cepaciano, ha inoltre permesso di determinare lo schema di acetilazione della stessa, utile per la possibile comprensione del ruolo biologico dei gruppi acetili, e di investigare alcuni passi del processo biosintetico dell’unità ripetitiva del polisaccaride. L’utilizzo di enzimi in grado di degradare il polisaccaride cepaciano è utile per demolire la matrice esopolisaccaridica presente attorno ai batteri e consentirne l’utilizzo in sinergia con terapie antibiotiche. In precedenza era stato trovato un enzima, prodotto da un ceppo ambientale di Bacillus, con attività liasica verso il cepaciano. Il suo isolamento per un futuro sequenziamento è stato oggetto di questa tesi. Questo enzima è in grado di idrolizzare una catena laterale dello scheletro polisaccaridico del cepaciano, così lasciando intatta la natura polimerica dell’EPS. Benché l’eliminazione di questa catena laterale provochi una decisa diminuzione della viscosità, probabilmente dovuta alla perdita di aggregazione, la ricerca di altri enzimi in grado di idrolizzare lo scheletro polimerico a frammenti a basso peso molecolare sarà oggetto di ricerche future. La quarta linea di ricerca ha coinvolto lo studio dell’interazione tra diversi EPSs con tre peptidi antimicrobici del sistema dell’immunità innata, appartenenti alla famiglia delle catelicidine. Negli esperimenti sono stati utilizzati esopolisaccaridi prodotti da Pseudomonas aeruginosa, Inquilinus limosus e ceppi clinici del Bcc. L’inibizione dell’attività dei peptidi è stata valutata tramite saggi di minima concentrazione inibente su un ceppo di Escherichia coli di riferimento in presenza o meno degli EPSs. La formazione di complessi tra peptidi ed EPSs è stata studiata per mezzo di misure di dicroismo circolare, di spettroscopia di fluorescenza e di microscopia a forza atomica. E’ stato infine proposto un modello in cui peptidi strutturati ad α-elica interagiscono con gli esopolisaccaridi mediante interazioni elettrostatiche e non covalenti. Infine, la ricerca ha coinvolto il polisaccaride capsulare prodotto da Neisseria meningitidis gruppo A, usato per sviluppare un vaccino coniugato dal Prof. N. Ravenscroft (Dip. di Chimica, Univ. di Cape Town). In base alle sue osservazioni sulla scarsa reattività del polisaccaride durante il processo di derivatizzazione necessario per la coniugazione con le proteine, è stata formulata l’ipotesi di una possibile aggregazione del polisaccaride capsulare in presenza di ioni Ca2+, derivanti dal processo di purificazione dello stesso. Per capire e risolvere questo problema, le proprietà conformazionali e morfologiche del CPS in presenza di ioni NH4+, Na+ e Ca2+ sono state studiate nel laboratorio di Trieste, mediante tecniche quali dicroismo circolare, spettroscopia di fluorescenza, viscosimetria e microscopia a forza atomica. La presenza di ione ammonio porta le catene polimeriche ad una conformazione più allungata, mentre lo ione sodio favorisce il ripiegamento delle catene in una conformazione globulare. L’addizione di calcio produce aggregazione di un limitato numero di polisaccaridi globulari per formare una struttura ‘toroidal-like’. Questi risultati giustificano la bassa solubilità del polimero in forma calcio e offrono una spiegazione della sua bassa reattività nella preparazione del coniugato proteico.
This PhD thesis focuses on polysaccharides (both capsular, CPSs, and exopolysaccharides, EPSs) produced by bacteria and released in the external environment as well as on their role in bacterial infections. For this, opportunistic bacteria involved in lung infections in cystic fibrosis (CF) patients were investigated. The results reported in the PhD thesis involved several topics and contributed to clarify different biological and chemical characteristics of bacterial polysaccharides. The first topic of the research has taken in account two structurally similar EPSs produced by a bacterium recently isolated from respiratory secretions of CF patients, Inquilinus limosus. The working hypothesis was that the two EPSs assume different conformations and therefore exert different biological activity. The conformational properties of these two EPSs were investigated by circular dichroism (CD) and atomic force microscopy (AFM) techniques, whereas the molecular modelling studies were carried out by Dr. M. Kuttel (Dept. of Chemistry, Univ. of Cape Town). The two polymers were shown to exhibit different helical conformations, stabilised by hydrogen bonding and characterised by charged pyruvate groups on the external helical surface. These findings confirming that the biosynthesis of two polymeric species might offer multiple tools to protect bacteria from external threats. The second part of the research involved cepacian, the EPS produced by the majority of bacteria belonging to the Burkholderia cepacia complex (Bcc). In this case, the isolation of its repeating unit (RU) from the internal bacterial membrane where it is bound to a lipid carrier prior to the EPS polymerisation was performed. A procedure to isolate cepacian repeating units was developed and the structure of the biological RU was determined by ESI-MS analysis. At the same time, the RU was useful to determine the acetylation scheme of cepacian, which could be connected with the biological role of acetyl groups, and to obtain information on its biosynthetic sequence. All the data obtained were considered in connection with the genetic investigation on the cepacian biosynthesis, carried out by Dr. C. Lagatolla (Dept. of Life Sciences, Univ. of Trieste). The third topic involved the search and identification of enzymes that can degrade cepacian in order to find biochemical tools able to degrade the EPS matrix present around bacteria and possibly used in synergy with antibiotic therapies. One lyase was found produced by Bacillus spp. and its isolation and sequencing is in progress. This lyase cleaves one of the lateral chains of cepacian backbone, thus living intact the polymeric nature of the EPS. Although the elimination of this lateral chain produces a marked lowering of the cepacian viscosity probably due to loss in aggregation ability, the search of different enzymes able to cleave the EPS backbone into oligosaccharides is still active. The fourth topic of the research focused on the interactions between different bacterial EPSs and three antimicrobial peptides, belonging to the cathelicidin family of primate’s innate immune system, to investigate the possible EPSs protective role towards bacterial cells. The experiments involved EPSs produced by Pseudomonas aeruginosa, Inquilinus limosus and clinical isolates of the Burkholderia cepacia complex. The inhibition of the peptides activity was assessed by minimum inhibitory concentration assays on a reference Escherichia coli strain in the presence and in the absence of EPSs. The complex formation between peptides and EPSs was investigated by means of CD, fluorescence spectroscopy and AFM. As a result, a model was proposed where peptides with a α-helical conformation interact with the EPSs backbone through electrostatic and non-covalent interactions. The last issue of the research involved the capsular polysaccharide produced by Neisseria meningitidis group A; this CPS is used to develop a protein conjugate vaccine by Prof. N. Ravenscroft (Dept. of Chemistry, Univ. of Cape Town). He observed that the derivatisation process, necessary prior to protein conjugation, yielded less product, in terms of protein-conjugate, than expected, and he thought that this was due to CPS aggregation in the presence of Ca2+, used in the purification steps. In order to solve this problem, the conformational and morphological properties of the CPS, in the presence of NH4+, Na+ and Ca2+ cations, were investigated in the Trieste laboratory. The study was carried out using different techniques such as circular dichroism, fluorescence spectroscopy, viscosity measurements and atomic force microscopy. It was shown that ammonium ions were associated with the presence of single polymer chains in an elongated conformation, whereas sodium ions favoured the folding of chains into a globular conformation. The addition of calcium ions produced the aggregation of a limited number of globular polysaccharide chains to form a ‘toroidal-like’ structure. This effect justified the polymer low solubility in the presence of calcium ions and offered an explanation of the polymer low reactivity in the preparation of the protein conjugate.
PhD cycle: XXII Ciclo
PhD programme: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
Description: 2008/2009
Keywords: bacterial polysaccharides
structure-function relationships
repeating units
cystic fibrosis
antimicrobial peptides
Main language of document: en
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/10 BIOCHIMICA
NBN: urn:nbn:it:units-8954
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