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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/4573

Title: Sviluppo di metodiche di mutagenesi ambientale a breve termine applicate a materiale vegetale
Authors: Russo, Annabella
Supervisor/Tutor: Tretiach, Mauro
Co-supervisor: Kosovel, Vera
Issue Date: 21-Apr-2011
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Il crescente inquinamento sta deteriorando sempre più il mondo in cui viviamo. Per studiare l’alterazione ambientale in modo completo è importante analizzare le emissioni da un punto di vista chimico-fisico, ma anche valutare il danno arrecato all’intero ecosistema. Perciò si impiegano sempre più spesso gli esseri viventi quali biomonitor di danno subito da un ambiente poiché sono capaci di reagire a stimoli complessi, talvolta sconosciuti, e danno informazioni più complete sulla qualità di un ecosistema rispetto a quelle fornite dai metodi tradizionali. Tra le emissioni inquinanti un ruolo particolare è occupato dalle sostanze mutagene capaci di modificare in modo stabile l’informazione genetica sia a livello di geni che di struttura e numero di cromosomi. I test capaci di identificare rapidamente mutazioni geniche e cromosomiche sono detti test di mutagenesi a breve termine. Nel percorso di dottorato ho sperimentato l’applicabilità di due test di mutagenesi ambientale: Tradescantia micronuclei test (Trad-MCN) e Comet test o Elettroforesi su Gel a Singola Cellula (SCGE), approfondendo alcune problematiche metodologiche. Tradescantia micronuclei test (Trad-MCN) Con Tradescantia micronuclei test (Trad-MCN) è possibile rilevare la presenza di micronuclei come indice di avvenuto danno al DNA nelle cellule del polline in piante del genere Tradescantia. Il test utilizza il clone  4430, ottenuto dall’incrocio di Tradescantia hirsutiflora e Tradescantia subacaulis. Alcuni esemplari del clone mi sono stati forniti dalla dott.ssa Maddalena Casera del Laboratorio Biologico dell’Agenzia Provinciale per la Protezione dell’Ambiente e la Tutela del Lavoro di Laives (BZ). Il clone, nel periodo invernale, è conservato all’interno di una serra dell’Orto Botanico dell’Università degli Studi di Trieste, a una temperatura di 24°C sotto una lampada a che riproduce un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 di buio. Nel periodo estivo, invece, il clone viene mantenuto all’esterno. Con le infiorescenze ottenute dal clone ho effettuato alcune prove di Trad-MCN test per comprendere a quale stadio si avessero le maggiori probabilità di osservare le tetradi polliniche. Inoltre ho effettuato due esposizioni di 15 infiorescenze ciascuna in un sito con elevate concentrazioni di IPA aerodispersi. Tale sito è ubicato in Piazza Garibaldi nel centro di Trieste, in una zona interessata da intenso traffico veicolare. Esaminando il contenuto delle antere e dividendo il numero totale di micronuclei per il numero totale di tetradi osservate si è definita la frequenza dei micronuclei, espressa come micronuclei/100 tetradi (MCN/100 tetradi). Per ogni esposizione si osservano 5 preparati e in ognuno si contano almeno 300 tetradi. Confrontando la media delle frequenze ottenute dalle infiorescenze esposte nel sito potenzialmente inquinato (media =5.44; σ =10.66 per la prima esposizione e media =5.54; σ =3.38 per la seconda esposizione) con quelle ottenute dal controllo (media =0.22; σ = 0.38 per la prima esposizione e media =1.00; σ = 0.32 per la seconda esposizione) si è potuta avere una conferma della compromissione dell’area esaminata. Le problematicità nell’utilizzo di questo protocollo riguardano per lo più la moltiplicazione delle piante e la loro protezione dagli attacchi dei parassiti. In questo senso sarebbe necessario affidare la lunga fase di moltiplicazione e cura delle piante a una struttura esterna, o avere a disposizione personale specializzato. La mancanza di un finanziamento ha impedito di estendere l’indagine sul territorio, com’era stato originariamente programmato. Comet test o Elettroforesi su Gel a Singola Cellula (SCGE) Il Comet test consente di studiare gli effetti causati da agenti mutageni su materiale genetico, permettendo di valutare il danno al DNA che si rileva come rotture dello scheletro fosfodiesterico in nuclei isolati da cellule eucariotiche. Tramite una corsa elettroforetica si evidenzia la disgregazione del DNA che assume la tipica forma di una cometa. La lunghezza della coda della cometa è proporzionale al danno subito dalla cellula. Tale test può essere eseguito su un numero basso di cellule (da alcune centinaia a poche migliaia) e con tempi di esecuzione e analisi di poche ore. Il protocollo che ho sperimentato è stato messo a punto dalla dott.ssa Patrizia Cesaro presso il Laboratorio di Biologia Vegetale del Dipartimento di Scienze dell’Ambiente e della Vita (Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali, Università degli Studi del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”- Alessandria) al fine di verificare l’eventuale compromissione di alcuni terreni provenienti da siti contaminati della provincia di Alessandria. La specie biomonitor che ho utilizzato è Vicia faba cv lunga delle cascine poiché facile da riprodurre, largamente usata per analizzare la mutagenicità di pesticidi, sostanze cancerogene e composti cromati e in grado di tollerare suoli salini. I semi di V. faba sono fatti germinare in capsule Petri del diametro di 15 cm. Ogni capsula contiene 22.5 g di sabbia di quarzo come materiale inerte (o di terreno potenzialmente contaminato da analizzare), 1 disco di carta bibula, 20 ml di acqua distillata sterile e 8/10 semi di V. faba (protocollo UNICHIM Metodo 1651-2003). Le capsule sono conservate in un termostato a 20-22°C. Il test prevede l’estrazione di nuclei da apici radicali di V. faba della lunghezza di circa 2 cm. La soluzione contenente i nuclei, opportunamente filtrata, è miscelata con gel di agarosio a basso punto di fusione e poi depositata su vetrini portaoggetti preventivamente trattati con gel di agarosio a normale punto di fusione. I vetrini così preparati sono sottoposti a una corsa elettroforetica (300 mA, 15 V) che permette la migrazione del DNA, carico negativamente, verso il polo positivo. La velocità di migrazione dipende dal peso molecolare: le molecole di DNA più piccole e compatte passeranno attraverso la matrice di agarosio più rapidamente rispetto ai frammenti più grandi. Terminata la corsa elettroforetica e previa colorazione si passa all’osservazione dei vetrini al microscopio ottico a fluorescenza: in caso di frammentazione del DNA, dovuta alla presenza di agenti mutageni, i nuclei non si presentano in forma compatta e tondeggiante bensì mostrano una cometa di lunghezza più o meno estesa. Le immagini al microscopio sono analizzate con il programma Comet Score in grado di calcolare tutta una serie di parametri quali: lunghezza della coda della cometa (in pixel), % di DNA nella coda della cometa, Tail moment e Olive moment. Il metodo Unichim per le germinazioni non prevede il contatto diretto tra radichetta e terreno. Il seme germinante riceve l’acqua per capillarità. Queste condizioni espongono potenzialmente i risultati ad una serie di artefatti in quanto si può ipotizzare che le sostanze idrosolubili si concentrino, per evaporazione, a livello della carta bibula e quindi in prossimità del seme. Le sostanze idrofobe, invece, potrebbero non entrare in contatto con l’apice radicale. E’ da sottolineare, inoltre, che la parte apicale delle radici interagisce in modo molto complesso con la rizosfera, ad esempio con la secrezione di ioni e molecole, alcune delle quali hanno lo specifico compito di aumentare la solubilizzazione di alcuni minerali del suolo, migliorando la nutrizione minerale della pianta. Sulla base di queste considerazioni, si è ritenuto interessante verificare eventuali differenze tra i risultati di Comet test effettuati su apici radicali cresciuti su carta bibula (protocollo standard) e Comet test effettuati alle medesime condizioni sperimentali su apici radicali a diretto contatto con il terreno ed immersi in esso. Al fine di trovare un terreno idoneo ad essere usato come bianco, ho eseguito alcune prove del test su semi cresciuti su terricci di diversa composizione, con le due modalità di germinazione appena descritte: • terriccio universale commerciale (torba, fibre lignee e cellulosiche, ammendante, concime organico, N 9%, P 6%, K 14%); • terriccio per agrumi commerciale (torba, letame e miscela di materiali vegetali); • terreno argilloso proveniente dalla pedemontana pordenonese nei pressi di Budoia (PN); • composta da semi J. Innes formulata dall’omonimo istituto inglese (2 parti di argilla di Budoia, 1 parte di torba irlandese e 1 parte di sabbia di quarzo); • terreno flyshoide sottoposto a biorimedio proveniente dal Parco di San Giovanni (TS). Il terriccio per agrumi e la composta Innes non sono consoni all’utilizzo come controllo a causa dei valori elevati di lunghezza della coda e percentuale di DNA nella coda dei nuclei isolati. Sarebbe interessante effettuare delle analisi chimiche al fine di comprendere se i problemi riscontrati sono dovuti alla presenza di metalli pesanti e/o acidi umici. Il terreno argilloso, il terriccio universale e quello flyshoide sottoposto a biorimedio hanno dato risultati migliori e, tra questi, si è scelto di usare il terzo poiché di esso si possiede un’analisi chimica dettagliata che conferma l’assenza di contaminazioni significative, sia di metalli pesanti che di composti organici.. I terreni potenzialmente contaminati elencati di seguito, sono stati valutati con entrambe le modalità di germinazione, usando come controllo il terreno proveniente dal Parco di San Giovanni - Trieste. Il primo terreno considerato proviene da un carotaggio eseguito sul litorale di Muggia - Trieste (sito denominato “Acquario”) dal Centro Interdipartimentale di Gestione e Recupero Ambientale (CIGRA) di Trieste, nell’ambito di un progetto di caratterizzazione e messa in sicurezza di un terrapieno artificiale formato con materiale di incerta origine. I campioni sono denominati con le seguenti sigle: SC-12A, SC-12B, SC-12C dove ‘SC’ indica che il carotaggio è avvenuto in zona costiera, ‘12’ fa riferimento al sito campionato e le lettere ‘A’, ‘B’, ‘C’ si riferiscono alle tre profondità di campionamento (‘A’: piano di campagna, ‘B’ un metro di profondità rispetto a ‘A’, ‘C’ livello medio del mare). Per quanto riguarda il campione A, i risultati delle analisi chimiche e del Comet test sono concordanti: tra i tre campioni di terreno questo campione è senza dubbio il meno compromesso. Emerge, tuttavia, una differenza tra i due protocolli: gli apici radicali cresciuti in capsule Petri mostrano un danno maggiore rispetto a quelli cresciuti a diretto contatto del suolo. Le analisi chimiche hanno evidenziato in questo la presenza di alte concentrazioni di Cobalto, Cromo e Nichel, tutti elementi idrosolubili. Queste sostanze si possono muovere, trasportate dall’acqua, fino a depositarsi tra le maglie della carta bibula quando il soluto è evaporato. Ne consegue una maggiore possibilità d’interazione tra queste sostanze e gli apici stessi. Il campione B mostra, da un punto di vista chimico, una compromissione maggiore rispetto al campione C. In entrambi i casi, la modalità di esposizione degli apici radicali influisce sui risultati: gli apici cresciuti a diretto contatto con il suolo mostrano maggiore compromissione rispetto a quelli cresciuti in capsule Petri. Dalle analisi chimiche emergono concentrazioni elevate di PCB e IPA che sono sostanze poco solubili in acqua, che non si muovono quindi per capillarità. Tali sostanze restano nel terreno e non si concentrano sulla carta bibula, che funge da barriera. Ciò non avviene per i semi che germogliano nei vasetti, con le radichette a diretto contatto del campione di suolo e delle sostanze in esso presenti. Sono stati esaminati anche altri campioni con analisi chimica nota: un terreno proveniente dall’area Caffaro di Torviscosa (UD) compromesso dalla presenza di metalli pesanti e un terreno proveniente dal Parco di San Giovanni (TS) con pesante contaminazione organica. In entrambi i casi si è avuta conferma del fenomeno: la crescita su carta bibula comporta una sovrastima della contaminazione da sostanze idrosolubili mentre porta ad una sottostima di quella indotta da composti scarsamente idrosolubili. Si può ipotizzare che le sostanze idrosolubili, come nel nostro caso gli ioni metallici, tendano ad accumularsi in prossimità degli apici radicali sulla carta bibula poiché questa agisce da superficie evaporativa. Ne consegue una sovrastima del danno rispetto alla reale biodisponibilità nel suolo. Al contrario, sostanze poco idrosolubili come PCB e IPA non sono traslocate e concentrate per cui la modalità espositiva sulla carta bibula comporta una sottostima degli effetti della loro presenza nel suolo. Inevitabilmente, lavorare con apici radicali che sono cresciuti a diretto contatto con il terreno comporta tempi di esecuzione del test più lunghi. Le particelle di terreno più grossolane devono essere allontanate, e gli apici attentamente lavati. Tuttavia si può affermare che questa metodica dà risultati più veritieri, a differenza di quella standard, comunemente impiegata in molte indagini di caratterizzazione ambientale, che sovrastima, o peggio, sottostima la reale compromissione della matrice analizzata.
PhD cycle: XXII Ciclo
PhD programme: METODOLOGIE DI BIOMONITORAGGIO DELL'ALTERAZIONE AMBIENTALE
Description: 2009/2010
Keywords: Comet test
Tradescantia micronuclei test
Test di mutagenesi
Vicia faba
SCGE
Trad-MCN test
Tradescantia #4430
Main language of document: it
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/03 BOTANICA AMBIENTALE E APPLICATA
NBN: urn:nbn:it:units-9073
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