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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/4582

Title: Ecologia trofica del Nanoplancton eterotrofo
Authors: Malisana, Elisa
Supervisor/Tutor: Fonda, Serena
Co-supervisor: Pallavicini, Alberto
Issue Date: 22-Apr-2011
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Il nanoplancton è costituito da organismi eucarioti unicellulari flagellati e non di dimensioni comprese tra 2 e 10 m. Sono in larga parte fotosintetizzanti (Primnesioficee, Prasinoficee, Crisoficee, Criptoficee, Dinoficee e piccole diatomee) (ShaPiro e Guillard, 1986). Alcuni sono eterotrofi (coanoflagellati, crisomonadi autotrofi facoltativi o non pigmentati, euglenoidi non pigmentati, dinoflagellati ed elioflagellati (Fenchel, 1982) e rappresentano i predatori più efficienti del picoplancton. Il nanoplancton eterotrofo (HNAN) costituisce la principale componente nelle reti trofiche marine capace di effettuare un controllo sulla biomassa picoplanctonica e di trasferire una porzione significativa della produzione batterica ai livelli trofici superiori (Fenchel, 1982; Azam et al., 1983; Berninger et al., 1991). Fino ad oggi scarsissime sono state le ricerche sulla frazione nanoplantonica negli ambienti profondi, dove presumibilmente i nanoflagellati giocano un ruolo di grande importanza, paragonabile a quello più volte dimostrato nella zona fotica (Gasol e Vaquè, 1993). Studi recenti hanno messo in evidenza che percentuali considerevoli della produzione superficiale possono raggiungere i sedimenti marini fino a profondità superiori ai 1000m. La sostanza organica sia in forma particolata che disciolta viene utilizzata dai procarioti eterotrofi per produrre nuova biomassa, l’unica prodotta negli ambienti profondi, che costituisce la base della rete trofica abissale. Attraverso la predazione dell’HNAN sui procarioti, tale risorsa viene veicolata ai consumatori dei livelli trofici superiori. Le conoscenze attuali sull’efficienza della predazione in ambienti abissali è quasi nulla e sono quasi sconosciuti i fattori che controllano le abbondanze degli eteronanoflagellati, la loro produzione e la loro efficienza come trasportatori di energia lungo le reti trofiche abissali. Lo scopo della mia ricerca è di quantificare il flusso di carbonio attraverso la comunità microplanctonica mediante la predazione dell’ HNAN sulla frazione picoplanctonica autotrofa ed eterotrofa in superficie e di stimare l’impatto della predazione degli HNAN sul comparto picoplanctonico eterotrofo nel sistema abissale. I campioni da analizzare in questa ricerca sono stati raccolti durante una campagna oceanografica denominata “Transmediterranean cruise” che rientra nel progetto VECTOR (CONISMA), i cui obiettivi sono volti ad approfondire le conoscenze relative agli impatti dei cambiamenti climatici sull’ambiente marino mediterraneo, focalizzando l’attenzione sui processi sedimentari, sui processi fisici e sui cicli biogeochimici, nonché sulla biodiversità.. La campagna si è svolta dal 28/05/2007 al 28/06/2007 nel bacino mediterraneo lungo un gradiente trofico decrescente ovest-est. Sono state prescelte dieci stazioni di campionamento: cinque nel mediterraneo occidentale (St. VA, V4, V3, V1, V2) e cinque nel mediterraneo orientale (St. V6, V7, V8, V10, Viera). In tutte le dieci stazioni previste nella campagna si è provveduto ad eseguire esperimenti di diluizione riguardanti la predazione dell’HNAN sul picoplancton eterotrofo batiale, mentre su nove stazioni sono stati effettuati esperimenti di diluizione relativi alla predazione dell’HNAN sul picoplancton superficiale autotrofo ed eterotrofo. In questo mio lavoro di ricerca si è scelto di utilizzare il metodo delle diluizioni introdotto nel 1982 da Landry ed Hasset, successivamente modificato da Landry et al. (1995) poiché nell’ultimo decennio è risultato il più utilizzato e può ormai essere considerato un protocollo standard, che, a differenza delle altre tecniche proposte, è estremamente semplice e non prevede alcuna manipolazione degli organismi. Mediante questo protocollo, è possibile calcolare sia il tasso di crescita delle prede, sia quello di predazione dei consumatori. Il tasso di predazione viene stimato attraverso la determinazione del tasso di crescita della preda in una serie di contenitori nei quali l’acqua campionata in una stazione viene diluita con acqua filtrata proveniente dalla medesima stazione. Le successive diluizioni riducono la probabilità d’incontro tra preda e predatore. Il metodo si basa sul presupposto che il tasso di predazione (g) sia linearmente correlato alla densità delle prede, che il coefficiente di crescita della preda (k) sia costante e indipendente dalla densità del popolamento (limitazione di nutrienti assente) e che il tasso di filtrazione si mantenga costante, indipendente dalla concentrazione delle prede. La variazione della densità delle prede (C) in un determinato periodo di tempo (t) può essere espressa dalla seguente equazione esponenziale: Ct = C0*e (k-g)*t ; dove, Ct è la biomassa alla fine dell’incubazione, C0 è la biomassa all’inizio dell’incubazione, k il tasso di crescita delle prede, g il tasso di mortalità dovuto alla predazione e t il periodo di incubazione. Il tasso di predazione corrisponde alla pendenza della retta di regressione tra crescita della preda e le frazioni di acqua diluita; il tasso specifico di crescita delle prede si ottiene estrapolando la crescita apparente in assenza di predatori. L’eventuale crescita dell’HNAN viene stimata come differenza tra la concentrazione finale e quella iniziale nei campioni al 100%. In esperimenti precedenti si è visto che nell’arco delle 24 ore di incubazione si assisteva ad una crescita significativa di questa frazione. In questo modo sarà possibile stimare l’efficienza del trasferimento energetico perché tale è la produzione secondaria. I campionamenti d’acqua di mare per gli esperimenti di diluizione sono stati effettuati alle stazioni prescelte mediante rosette dotata di 24 bottiglie Niskin, sia in superficie che nella zona batipelagica e l’acqua di mare è stata filtrata su un retino da 10 m per eliminare i predatori di dimensioni superiori all’ HNAN. L’acqua così ottenuta, è stata diluita con acqua di mare proveniente dalla medesima stazione e filtrata mediante pompa peristaltica su membrana idrofila di PFTE Millipore con porosità pari a 0.22 m (acqua marina priva di organismi vitali eccetto piccoli batteri). Per valutare la predazione dell’HNAN sui batteri sono stati allestiti a bordo quattro diluizioni nelle seguenti proporzioni: 100%, 80%, 50%, 20%, in tre repliche ognuna. La serie di campioni è stata preparata al T0 e al T24. I campioni sono stati incubati sul ponte delle navi per un tempo pari a 24 ore, alle condizioni simulate in situ utilizzando vasconi in cui si è provveduto a far scorrere acqua di mare superficiale che mantengono le condizioni di temperatura ed irradianza più prossimi a quelli della profondità di prelievo. Al tempo T0 e al tempo T24 sono state effettuate le analisi dei parametri. I campioni del batipelagico sono stati incubati anch’essi per 24 ore alle condizioni simulate in situ, al buio e in un frigorifero opportunamente tarato alla temperatura di prelievo. I campioni di nanoplancton sono stati fissati in gluteraldeide all’1% e tenuti in frigo; quelli di picoplancton sono stati fissati in formalina al 2%, precedentemente filtrata su 0.22 m e posti in frigo. I campioni di nanoplancton e picoplancton, sono stati filtrati in laboratorio mediante rampa su membrane NTG nere a diversa porosità, previa colorazione con DAPI e successivamente analizzati al microscopio ad epifluorescenza. Per il conteggio della frazione eterotrofa sono stati utilizzati i raggi UV, mentre la componente autotrofa è stata osservata ad eccitazione nel campo della luce verde. Gli organismi nanoplanctonici sono stati distinti in tre classi dimensionali : < 3 µm, tra 3 e 5 µm e > 5 µm. I valori di cellule per litro sono stati convertiti in biomassa di carbonio tramite l’applicazione di fattori di conversione reperibili in letteratura. L’efficienza delle diluizioni è stata verificata in tutte le stazioni della quota abissale: all’aumento del fattore diluizione corrisponde un’effettiva diluizione degli organismi al momento T0. Tutte le regressioni sono risultate significative ed è stata rilevata attività di predazione in tutte le stazioni del batipelagico. Solamente in VA alla mortalità di predazione si è aggiunta la mortalità naturale del popolamento picoplanctonico. La biomassa dei procarioti eterotrofi varia da 0.14 ± 0.01 a 1.78 ± 0.15 µg C L-1, con un incremento medio nel settore orientale, mentre il nanoplancton presenta valori di biomassa relativamente stabili con il picco minimo rilevato nella stazione Tirrenica (0.02 ± 0.01 µg C L-1) ed il massimo in V8 (0.21 ± 0.05 µg C L-1 ). I valori calcolati di produzione secondaria risultano variabili e in tre stazioni non c’è stata alcuna produzione a carico dei predatori di dimensioni minori. I tassi di ingestione variano da 0.05 a 5.91 µg C L-1 g -1,e in media sono più elevati nei campioni del settore orientale dove, tuttavia, il controllo top down è meno efficace essendo il coefficiente di crescita (k) maggiore di quello di mortalità da predazione (g) nella maggior parte dei casi. Nel settore occidentale il controllo da parte della predazione sulla biomassa batterica è efficiente in 3 stazioni su 4. E’ stata evidenziata una relazione tra il tasso di ingestione e la biomassa batterica: all’aumento della biomassa delle prede, corrisponde anche un incremento della loro ingestione fino a raggiungere un valore massimo che rappresenta il livello di saturazione. Il tasso di ingestione risulta essere anche correlato linearmente con la produzione potenziale batterica. I valori massimi di ingestione sono associati ai valori massimi di produzione potenziale e questo potrebbe indicare che l’attività di predazione è principalmente rivolta alla frazione batterica potenzialmente più produttiva e metabolicamente più attiva. Questi risultati relativi al batipelagico sono stati presentati in un poster al convegno IMBER IMBIZO svoltosi a Miami dal 9 al 13 novembre 2008. Recentemente in collaborazione con il gruppo di ricerca del Dipartimento di Scienze Marine dell’Università delle Marche è stato pubblicato il lavoro dal titolo “Disentangling the impact of viruses and nanoflagellates on prokaryotes in bathypelagic waters of the Mediterranean Sea”(2010) Mar. Ecol. Progres. Ser., Vol. 418:73-85. Per verificare i dati ottenuti nel Mediterraneo batipelagico si è allestito un nuovo esperimento di diluizione campionando acqua profonda (1500 m) in una stazione posta nel Golfo del Leone. Il campionamento è stato effettuato a fine settembre del 2010. Sono state preparate 4 diverse percentuali di diluizione: 100%, 90%, 70% e 10%, in tre repliche ciascuna. Il metodo relativo all’allestimento dell’esperimento, la fissazione dei campioni, filtrazione e conteggio è stato precedentemente descritto. L’efficienza della diluizioni è stata verificata e a questa è seguita l’analisi della crescita apparente che ha permesso di evidenziare un controllo di tipo top down esercitato dal nanoplancton eterotrofo sulle loro prede, andando a confermare i risultati relativi alla predazione rilevati nelle altre stazioni precedentemente indagate. La numerosità e la biomassa di prede e predatori sono in linea con i dati precedentemente ottenuti nelle stazioni Mediterranee e con i dati reperiti in letteratura e seguono la tendenza di una diminuzione di circa 2-3 ordini di grandezza rispetto a quelli relativi alla quota superficiale. L’efficienza delle diluizioni è stata anche verificata in tutte le stazioni superficiali dell’intero bacino del Mediterraneo per la frazione picoplanctonica eterotrofa ed autotrofa: all’aumento del fattore diluizione corrisponde un’effettiva diluizione degli organismi al momento T0. In alcune stazioni (VA, V1,Viera e V10) non è stato possibile eseguire il conteggio della frazione autotrofa a causa della perdita di fluorescenza dei fotopigmenti. Relativamente al picoplancton eterotrofo, le regressioni sono risultate significative ed è stata rilevata attività di predazione in tutte le stazioni, cosa che non è stata osservata in nessuna stazione per il comparto autotrofo. La biomassa dei batteri eterotrofi varia da 1.6 ± 0.06 µg C L-1 a 4.8 ± 0.6 µg C L-1 µg C L-1, con il valore massimo rilevato nella stazione Atlantica ed il minimo in Viera, in corrispondenza di una zona di downwelling. In accordo con il gradiente trofico decrescente ovest-est, si nota un decremento medio di biomassa procariotica eterotrofa passando dal settore occidentale a quello orientale. Le biomasse della frazione autotrofa sono basse e non raggiungono 1 µg C L-1 , ad eccezione di V4, dove il valore medio si attesta a 1.5 µg C L-1. Il nanoplancton totale risulta in media più abbondante nelle stazioni occidentali e la classe dimensionale dominante è quella < 5 µm. Per discriminare la frazione eterotrofa da quella autotrofa (distinzione non visibile al microscopio ad epifluorescenza a causa della perdita della capacità di fluorescenza dei fotopigmenti) si è considerato come riferimento un dato reperito in letteratura che attribuisce ai potenziali predatori (esclusivamente eterotrofi) il 24% della biomassa totale (Jürgens and Massana, 2008). I valori di produzione secondaria a carico dei soli eteronanoflagellati variano da 0.09 µg C L-1 d-1 a 3 µg C L-1 d-1 e in 2 casi (V6 e Viera) non c’è alcuna crescita dei predatori. I tassi di ingestione relativi alla frazione eterotrofa variano da un valore prossimo allo 0 rilevato in V3 a quello massimo Atlantico di 9.54 µg C L-1 d-1. Al contrario della zona batiale dove si osserva un maggior controllo di tipo top-down nel settore occidentale (g > k), questa zonazione non emerge nella quota superficiale dove i valori di k e g sono indipendenti dall’area di campionamento. Così come per il batipelagico, i valori massimi di ingestione sono associati ai valori massimi di produzione potenziale. I risultati relativi agli effetti sinergici ed antagonisti della predazione del microzooplancton e dei nanoflagellati sui procarioti autotrofi ed eterotrofi sono stati presentati al XIX Congresso dell’A.I.O.L. svoltosi a Venezia dal 22 al 25 settembre 2009. Dall’unione dei dati abbiamo evidenziato 4 diversi modelli: 1) nella stazione Ligure, la potenziale predazione esercitata dai nanoflagellati sul comparto eterotrofo picoplanctonico viene inibita dalla predazione del microzooplancton sui nanoflagellati stessi portando pertanto all’assenza di mortalità picoplanctonica dovuta alla predazione; 2) nelle st. V6 e VA, il controllo del microzooplancton sui nanoflagellati è meno efficace e il tasso di ingestione non viene più inibito ma dimezzato; 3) nelle st. V7 e V10 i tassi di ingestione nei 2 esperimenti sono simili ma, essendoci una predazione rivolta ai nanoflagellati, si può ipotizzare una pressione diretta quasi esclusiva del microzooplancton sui procarioti eterotrofi; 4) in V2, V3 e Viera, il microzooplancton non controlla la biomassa nanoplanctonica e, alla pressione da predazione esercita dai nanoflagellati sui procarioti eterotrofi, si somma quella effettuata direttamente dal microzooplancton. In collaborazione con il gruppo di ricerca del Dipartimento di Scienze Marine dell’Università delle Marche, è stato presentato un lavoro al congresso CIESM (Venezia 2010) dal titolo “Virus-prokaryote-nanoflagellate-microzooplankton interactions in surface waters of the mediterranean sea”. Per valutare l’effetto selettivo della predazione sul popolamento procariotico abbiamo allestito un nuovo esperimento di diluizione effettuato nel mese di giugno 2009 presso il NIB di Pirano, Slovenia. Lo scopo di questo lavoro è di evidenziare la variazione quali – quantitativa delle prede indotta dalla pressione di predazione esercitata dai nanoflagellati. Attraverso il conteggio all’epifluorescenza e applicando il metodo delle diluizioni si è stimata la variazione quantitativa delle prede; mediante l’estrazione del DNA e tramite successiva amplificazione abbiamo ottenuto i campioni per l’indagine qualitativa. Il sequenziamento e l’analisi filogenetica dei campioni all’inizio e alla fine dell’esperimento ci hanno permesso di valutare la variazione delle comunità picoplanctoniche a causa della pressione da predazione. Al momento del prelievo dell’acqua di mare superficiale si è proceduto immediatamente alla filtrazione su rete da 10 μm al fine di eliminare tutti gli organismi di dimensioni maggiori alla frazione nanoplanctonica. Sono state poi allestite le diluizioni con la stessa acqua filtrata su 0.22 μm con pompa peristaltica, priva quindi di ogni organismo. Le proporzioni di diluizione utilizzate sono 100% (solo acqua filtrata su 10 μm), 80%, 50%, 10%. Da queste sono stati preparati i campioni: quelli rappresentanti il T0 sono stati immediatamente fissati, quelli rappresentanti il T24 sono stati fissati dopo 24h di incubazione. Parallelamente all’allestimento delle diluizioni è stato allestito l’esperimento per l'analisi genetica. Il bianco è stato preparato filtrando l’acqua direttamente su 3 μm e procedendo alla successiva incubazione per il T24, si è voluta eliminare la frazione nanoplanctonica per poter valutare la possibile modifica della comunità picoplanctonica dipendente dal cosiddetto “effetto bottiglia” e quindi la variazione della medesima comunità in seguito a filtrazione in assenza del predatore. I campioni del 100% al T0 ed al T24 dopo filtrazione su 3μm per eliminare la frazione nanoplanctonica sono stati raccolti su filtro da 0.22 μm. A questo punto il filtro è stato sezionato in quattro parti uguali con bisturi a lama sterile. Ogni porzione del filtro è stata accuratamente impacchettata ed interamente ricoperta con volumi variabili di lysis buffer (Bostrom, 2004) e conservata in falcon da 15 mL a -80°. Anche i campioni del bianco sono stati trattati allo stesso modo. Il protocollo d'estrazione del DNA è stato messo a punto sulla base di quello derivato da Giovannoni et al. (1990). Il pirosequenziamento (454), una delle nuove tecniche di sequenziamento ad elevato parallelismo basata sul principio del "sequencing by synthesis"; consente di ottenere 100 milioni di basi in meno di 8 ore ed ha permesso la prima analisi tassonomica della comunità batterica del Nord Adriatico. Per questo lavoro il sequenziamento è stato eseguito dal "Biotechnology Center" dell'Illinois. Per l'analisi bioinformatica delle sequenze ottenute è stato usato l' RDP (Ribosomal database Project) (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp). La visualizzazione delle sequenze classificate è stata effettuata utilizzando VAMPS (vamps.mbl.edu/overview.php). L'analisi statistica delle quattro librerie è stata fatta con IDEG6, un software disponibile online (http://telethon.bio.unipd.it/bioinfo/IDEG6_form/index.html). I dati ottenuti dall'analisi quantitativa dimostrano come il nanoplancton eterotrofo eserciti una predazione attiva sul picoplancton eterotrofo, ma non tale da determinarne il controllo, mentre non esercita predazione sul comparto autotrofo. Infatti, la correlazione rilevata fra crescita apparente del popolamento eteropicoplanctonico ed il grado di diluizione evidenziano la predazione da parte dell'eteronanoplancton, ma il valore assoluto di g (tasso di predazione) risulta minore di k (tasso di crescita apparente), indicando l'assenza di controllo top-down. L’analisi delle sequenze ha evidenziato una comunità prevalentemente composta da Proteobacteria, (Alphaproteobacteria) a cui appartengono due delle famiglie più rappresentative: le Rhodobacteraceae chemiorganotrofe e fotoeterotrofe e le Rhodospirillaceae prevalentemente fotosintetizzanti. La famiglia delle Flavobacteriaceae (Bacteroidetes) prevalentemente eterotrofa, è il secondo gruppo più abbondante nei campioni analizzati. Contribuiscono all’incremento della diversità dei campioni al T0 i Cyanobacteria e le Chitinophagaceae. Quest’ultime mostrano un incremento più significativo nei campioni del T24. Il confronto tra le sequenze analizzate nei campioni è risultato statisticamente significativo per dieci taxa. Dall'analisi delle sequenze si è osservata una predazione a carico dei gruppi meno abbondanti del comparto autotrofo (Cyanobacteria) non rilevabile altresì con gli esperimenti di diluizione. Il confronto tra i campioni T24 3μm e T24 100% evidenzia come quei taxa che non sono sottoposti ad un controllo di tipo top-down, per l'assenza del predatore, possano andare incontro a lisi virale secondo il modello "killing the winner" (Fuhrman & Suttle, 1993; Thingstad et al., 1993; Tingstad & Lignell, 1997). I risultati dell’analisi statistica sono stati graficamente risolti utilizzando MEGAN (www-ab.informatik.uni-tuebingen.de/software/megan), un software disponibile on line per le analisi di metagenomica.
PhD cycle: XXIII Ciclo
PhD programme: METODOLOGIE DI BIOMONITORAGGIO DELL'ALTERAZIONE AMBIENTALE
Description: 2009/2010
Keywords: Nanoplancton
Mediterraneo
Batipelagico
Metagenomica
Main language of document: it
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/07 ECOLOGIA
NBN: urn:nbn:it:units-9079
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