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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/7409

Title: New insights into the architecture and function of SbmA, an unusual transporter of the inner membrane of E. coli
Authors: Runti, Giulia
Supervisor/Tutor: Gennaro, Renato
Co-supervisor: Scocchi, Marco
Issue Date: 24-Apr-2012
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: SbmA/BacA è una proteina della membrana interna presente nei batteri Gram negativi e caratterizzata da omologia di sequenza con i domini transmembrana (TMDs) dei sistemi di trasporto di tipo ABC. Ceppi di E. coli con una delezione completa del gene sbmA mostrano un’aumentata resistenza al peptide antimicrobico Bac7 e ad altri peptidi ricchi in prolina a seguito di una loro ridotta internalizzazione. Gli omologhi di SbmA in altre specie sono essenziali per instaurare un’infezione cronica sia in ospiti di origine vegetale che animale. Lo scopo del presente lavoro è stato caratterizzare l’organizzazione e la funzione del sistema di trasporto rappresentato da SbmA in E. coli. Mediante saggi di cromatografia di affinità e di anisotropia a fluorescenza, è stato mostrato come SbmA sia in grado di legare Bac7 senza la necessità di una proteina di legame del substrato (SBP). Inoltre, mediante la tecnica del doppio ibrido in batterio e saggi di crosslinking in vitro, è stato mostrato come SbmA formi dimeri sia in vivo sia in vitro. Saggi di citofluorimetria in presenza di diversi inibitori metabolici indicano come la presenza di un gradiente protonico sia essenziale per garantire il trasporto del peptide attraverso la membrana batterica, trasporto che sembra essere indipendente dall’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP. Allo scopo di identificare possibili interattori di SbmA, è stato analizzato il locus genomico di sbmA ed è stato dimostrato che il gene yaiW, localizzato a valle di sbmA, forma con quest’ultimo un’unica unità trascrizionale. Sebbene i due geni siano cotrascritti, le corrispondenti proteine non sembrano interagire né a livello citoplasmatico né di membrana interna. Tuttavia, l’interazione tra queste due proteine a livello periplasmico non può essere esclusa ed il coinvolgimento di YaiW nell’internalizzazione di Bac7 mediata da SbmA può essere ipotizzato sulla base dell’aumentata resistenza al peptide mostrata dal ceppo con una delezione completa del gene yaiW. Dal vaglio in vivo dell’intero proteoma di E. coli versus SbmA mediante il sistema BACTH non è stato identificato alcun dominio di legame dell’ATP, rafforzando quindi l’ipotesi che il sistema di trasporto rappresentato da SbmA non richieda l’idrolisi dell’ATP come fonte di energia. Questo studio ha permesso di identificare 9 possibili interattori di SbmA, tra i quali la proteina della membrana interna FieF, coinvolta nell’efflusso di ioni Zn(II) dalla cellula batterica. E’ stato mostrato come FieF sia coinvolta nell’internalizzazione di Bac7 mediata da SbmA e come l’espressione di sbmA sia modulata dagli ioni Zn(II) in maniera complessa, suggerendo un possibile ruolo per questa proteina nella risposta allo stress da parte del batterio. Questi risultati suggeriscono come SbmA sia un insolito trasportatore di peptidi derivato dalla famiglia dei trasportatori ABC, che ha successivamente perso e/o cambiato nel corso dell’evoluzione alcune caratteristiche, come ad esempio la necessità di una proteina di legame del substrato o la fonte di energia richiesta per il trasporto dei substrati. Inoltre, l’interazione osservata tra le due proteine SbmA e FieF potrebbe suggerire un possibile ruolo della prima nel processo di detossificazione dello zinco, attività che potrebbe essere modulata dal legame di un substrato di natura peptidica a SbmA. Infine, la regolazione dell’espressione di sbmA mediata dagli ioni Zn(II) potrebbe avere un ruolo fisiologico nell’ospite in quanto promuove una maggiore suscettibilità dei batteri ai peptidi antimicrobici ed è in grado di attivare effettori cellulari come i neutrofili.
SbmA/BacA is a protein of the inner membrane of many Gram negative bacteria, predicted to be the transmembrane domain of an ABC transport system. sbmA-deleted E. coli strain shows an increased resistance to the antimicrobial peptide Bac7 and other proline-rich peptides due to their reduced uptake. In addition, BacA of some Gram negative species is essential to establish chronic infection in animal and plant hosts. The aim of this study was to characterize the architecture and function of the SbmA transport system in E. coli. By affinity chromatography and fluorescence anisotropy assays we showed that SbmA is able to bind Bac7 also without the requirement of a substrate-binding protein. By using a bacterial two-hybrid BACTH system and in vitro crosslinking assay we showed that SbmA forms dimers both in vivo and in vitro. Flow cytometry analysis using different metabolic inhibitors indicate that the proton motive force rather than ATP hydrolysis may represent the driving force for the translocation of peptide substrates. Searching for possible interactors of SbmA, we showed that the yaiW gene, located downstream of sbmA, is part of the same operon. Even if the two genes are cotranscribed, the corresponding proteins do not seem to interact neither at the cytoplasmic nor at the inner membrane level. However, ΔyaiW strain showed an increased resistance to Bac7 suggesting the involvement of this protein in the SbmA-mediated uptake of the peptide. An in vivo screening of the whole proteome of E. coli against SbmA by the BACTH system did not identify any nucleotide-binding domain of the transporter, strengthening the hypothesis that the transport system is energized by a mechanism different from ATP hydrolysis. Two-hybrid analysis allowed us to fish out 9 potential interactors and among those our attention was focused on FieF, an inner membrane protein involved in zinc efflux from the bacterial cell. We demonstrated that FieF is involved in the SbmA-mediated uptake of Bac7 and that the expression of sbmA is modulated by zinc ions in a complex manner, suggesting a stress role for this protein in bacteria. Overall, these findings suggest that SbmA is an unusual peptide transporter likely derived from the widespread ABC transporters, which has evolutionary lost/changed some typical features of this transport systems, such as the request of a substrate-binding protein and the ATP binding domain. The interaction between SbmA and FieF points to a possible involvement of the former in zinc detoxification, a function which may be modulated by the binding of an unidentified peptide substrate. The regulation of the expression of SbmA by zinc ions might have a physiological relevance in the host because it makes the target bacteria more susceptible to the AMPs and activates cellular effectors such as the neutrophils.
PhD cycle: XXIV Ciclo
PhD programme: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
Description: 2010/2011
Keywords: SbmA
ABC transporter
zinc ions
Bac7
antimicrobial peptides
Main language of document: en
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/10 BIOCHIMICA
NBN: urn:nbn:it:units-9216
Under Embargo until: 24-Apr-2015
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