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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/7428

Title: Nuovi approcci terapici in modelli murini di neurodegenerazione di tipo Alzheimer
Authors: Kleiner, Giulio
Supervisor/Tutor: Leanza, Giampiero
Issue Date: 17-Apr-2012
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: La demenza di tipo Alzheimer (AD) rappresenta una delle principali patologie che affliggono la nostra società. Purtroppo, i trattamenti terapeutici oggi disponibili non sono in grado di bloccare l’inesorabile esito della malattia, ma solo di rallentarlo. Pertanto, lo studio di nuove strategie terapiche e la successiva validazione delle stesse sono obiettivi prioritari della ricerca, con robuste analisi da effettuare su modelli animali affidabili. Attualmente, nessuno dei modelli sperimentali di AD disponibili ricapitola in maniera soddisfacente i deficit funzionali e istopatologici propri della malattia. Molti studi si sono concentrati sulla deplezione del sistema colinergico del basal forebrain, associata classicamente ai deficit cognitivi; altri, facendo per lo più uso di animali transgenici, hanno investigato il possibile ruolo neurotossico del peptide β-amiloide, ottenendo tuttavia solo modeste alterazioni cognitive o neurochimiche. La disponibilità di un modello animale adeguato è pertanto fondamentale per valutare l’affidabilità di nuovi possibili approcci terapeutici. Negli ultimi anni diversi studi hanno dimostrato un importante coinvolgimento dei recettori sigma-1 nelle funzioni cognitive. Come risultato, sostanze agenti come agonisti dei recettori sigma-1 hanno attratto notevole interesse come promettenti composti ad azione pro-cognitiva. In particolare, i sigma-1 agonisti finora testati hanno manifestato efficacia variabile nel contrastare e migliorare, in vari modelli di malattia, il deficit mnemonico indotto da vari trattamenti. È possibile che questi ligandi migliorino l’apprendimento e la memoria attraverso un’azione diretta su propri recettori, espressi abbondantemente nelle regioni corticali e ippocampali implicate nei processi cognitivi, anche se non si può escludere una attivazione concomitante di altri recettori. Recenti studi hanno anche rilevato livelli anormali di proteina TDP 43, una ribonucleoproteina che contribuisce a formare aggregati proteici in pazienti colpiti da SLA, demenza frontotemporale e anche in pazienti con malattia di Alzheimer (più del 200% dei livelli normali). Alcune evidenze inoltre ritengono che un contributo importante all’insorgenza dei deficit cognitivi spaziali sia dovuto a una concomitante perdita di neuroni cerebellari. Tuttavia non è ancora non è noto se la lesione cerebellare sia sufficiente alla comparsa di questi deficit o se ci sia bisogno di un contemporaneo malfunzionamento di altri sistemi neuronali, come appunto quello colinergico basale affinché tali deficit divengano apparenti. Nel nostro laboratorio, abbiamo recentemente introdotto un modello murino che manifesta contemporaneamente alcune delle principali caratteristiche comportamentali e istopatologiche della malattia di Alzheimer. Lo scopo del lavoro è stato caratterizzare i deficit esibiti da tale modello, e su di esso testare diverse strategie terapiche. Per quest’ultimo scopo, sono stati impiegati due composti non commerciali di sintesi, denominati (-)-MR 22 e (±)PPCC, con azione agonista verso i recettori sigma-1 e la cui efficacia come neuroprottettori è già stata dimostrata in vitro, ma le cui possibili azioni pro-cognitive in vivo non sono note. Inoltre, dopo la caratterizzazione comportamentale e immunoistochimica, sono stati investigati i cambiamenti a livello molecolare di alcune sostanze chiave nello sviluppo della malattia quali APP, ChAT e TDP43, molecole il cui metabolismo è o sembra essere alterato in una situazione patologica di tipo Alzheimer. In particolare si è cercato di capire se la somministrazione dei sigma ligandi, oltre a migliorare la performance cognitiva, potesse normalizzare queste alterazioni proteiche. In esperimenti paralleli, si è iniziato a studiare il possibile coinvolgimento dei neuroni colinergici cerebellari nell’insorgenza dei deficit cognitivi spaziali in un modello murino di disfunzione cerebellare. Deplezioni colinergiche selettive e infusioni cerebrali localizzate di peptide amiloide 25-35 preaggregato e ligandi sigma sono state prodotte, separatamente o in congiunzione, in gruppi separati di ratti adulti, in modo da replicare i segni cognitivi e istopatologici della malattia e soprattutto investigare possibili interazioni tra i vari aspetti che potessero alterare, aggravandolo, il quadro generale. In tutti i soggetti studiati, frammenti di tessuto dell’ippocampo e della corteccia frontoparietale sono stati asportati e sottoposti a procedure di Western Blotting e RT PCR per valutare eventuali variazioni di mRNA e/o espressione proteica in seguito ai trattamenti. Le rimanenti porzioni sono state fissate ed utilizzate per analisi isto- ed immunoistochimiche. Gli animali con doppio trattamento (ossia lesione colinergica e infusione di amiloide) hanno presentato deficit di apprendimento e memoria spaziali superiori non solo rispetto ai controlli, ma anche ai gruppi che avevano ricevuto il trattamento singolo. A livello istochimico gli animali con doppia lesione presentavano una marcata deafferentazione colinergica corticale e ippocampale associata a gravi deplezioni neuronali nei nuclei d’origine e alla presenza di numerosi aggregati di proteina amiloide nelle regioni di iniezione. Con la tecnica del Western Blot, si è anche osservato che gli animali con doppia lesione esprimevano livelli aumentati del precursore proteico dell’amiloide (APP) non riscontrabili nei soggetti con trattamento singolo. Su tale modello, si è investigato il ruolo antiamnesico e neuroprotettivo di nuovi composti assimilabili alla famiglia degli agonisti dei recettori sigma-1. Negli esperimenti riportati nel presente lavoro, i composti (-)-MR 22 e (±)PPCC si sono rivelati efficaci nel migliorare le performance cognitive nei vari test impiegati, in particolare il primo è stato anche in grado di normalizzare anche l’espressione regionale di APP. L’azione di questi composti si esercita essenzialmente migliorando le performance degli animali durante i test comportamentali, mentre non appare modificata la morfologia tissutale e la deplezione tissutale degli animali trattati. Ulteriori esperimenti sono attualmente in corso. L’azione antiamnesica e neuroprotettiva indotta da (-)-MR 22 in vivo è interessante e in linea con recenti evidenze che attribuiscono un notevole potenziale terapeutico ai sigma-1 agonisti. Gli animali trattati infatti hanno esibito livelli di APP prossimi al normale; ciò suggerisce un ruolo del signaling sigma-1 nel promuovere meccanismi fisiologici di espressione e metabolismo di APP, inibendone la possibile azione citotossica. La RT-PCR per ChAT effettuata su omogenati di ippocampo ci ha dato una ulteriore conferma sulla avvenuta lesione colinergica in seguito alla somministrazione della tossina saporina. Mentre la stessa analisi per TDP43 sembra rilevare un effettivo aumento nella produzione dell’mRNA di questa proteina, perlomeno negli animali trattati con la tossina colinergica, anche se sono necessari ulteriori esperimenti per stabilire quale sia il reale apporto delle lesioni nei cambiamenti visti con la Real Time PCR. Gli animali trattati con l’immunotossina sia nei nuclei del forebrain basale sia in cervelletto mostrano evidenti deficit nelle performance dei test comportamentali di memoria spaziale rispetto agli animali lesionati solo in cervelletto o solo nei nuclei del forebrain basale, indicando un possibile coinvolgimento dei neuroni cerebellari nell’elaborazione delle informazioni di cognizione spaziale. Un altro approccio terapeutico che si intende testare in futuro è rappresentato dal trapianto, nelle aree cerebrali lesionate, di progenitori neurali di varia provenienza. Di tali cellule si studierà la capacità di integrazione anatomica e di promozione del recupero funzionale e di normalizzazione delle alterazioni istopatologiche. Un ulteriore approfondimento riguarda la natura della proteina amiloide da noi visualizzata nel tessuto cerebrale del ratto. Studi futuri serviranno ad appurare se, in presenza di una disfunzione colinergica, l’iniezione di proteina amiloide esogena preaggregata possa rappresentare l’innesco per un processo di reclutamento di Aβ endogena. Infine, verranno investigate le eventuali modificazioni che il modello di doppia lesione porterebbe al metabolismo della proteina tau. Se, cioè, la presenza della deplezione colinergica e l’aumentata espressione di APP, e quindi di aggregati di proteina beta-amiloide, portino effettivamente a uno squilibrio nel balance tra proteina tau fisiologicamente fosforilata e proteina tau iperfosforilata, a favore di quest’ultima.
PhD cycle: XXIV Ciclo
PhD programme: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NEUROSCIENZE E SCIENZE COGNITIVE - indirizzo NEUROBIOLOGIA
Description: 2010/2011
Keywords: Malattia di Alzheimer
Immunolesione
Sistema colinergico
Deposito di peptide amiloide
Recettori sigma-1
Proteina TDP43
Cervelletto
Main language of document: it
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/09 FISIOLOGIA
NBN: urn:nbn:it:units-9204
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