OpenstarTs >
Ricerca >
Tesi di dottorato >
Scienze biologiche >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/7737

Title: Autoanticorpi nelle malattie neurologiche
Authors: Zulian, Stefania
Supervisor/Tutor: Tongiorgi, Enrico
Issue Date: 20-Mar-2012
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Esistono più di 50 diverse patologie neurologiche che hanno una confermata o sospetta eziologia autoimmune e che si stima colpiscano 75 milioni di persone nel mondo. Sebbene negli ultimi anni sia cresciuto l’interesse per i meccanismi immunopatologici anticorpo-mediati, le evidenze di un ruolo primario degli autoanticorpi nella patogenesi delle malattie autoimmuni del SNC sono ancora poche. La maggior parte di queste patologie è rara e per molte di esse non esiste un metodo di diagnosi in quanto l’antigene (o gli antigeni) bersaglio della risposta autoimmune sono sconosciuti. A tale scopo risulta fondamentale il supporto di un test diagnostico che aiuti ad identificare la presenza di tali anticorpi nel siero dei pazienti. Lo scopo del mio progetto di Dottorato è stato la messa a punto di un metodo di identificazione di anticorpi anti-neurali caratteristici di diverse patologie che utilizza l’immunoistochimica su sezioni di cervello di ratto. Questo metodo è stato quindi testato per la rilevazione di autoanticorpi antineurali in particolare in 4 gruppi di patologie neurologiche: le sindromi Paraneoplastiche, la Neuromielite Ottica, le Neuropatie periferiche e Sclerosi Laterale Amiotofica (SLA). La ricerca di questa tesi di dottorato si è sviluppata seguendo tre obbiettivi specifici: 1. Creare un metodo di controllo qualità per il saggio di analisi immunoistochimica TABA e valutare la sua validità diagnostica. 2. Sviluppare un test che permetta l’analisi della reattività dei sieri di pazienti che presentano neuropatie non ancora classificate perché ad antigene ignoto. 3. Testare con la metodica TABA di immunoistochimica semi-quantitativa su sezioni di cervello di ratto sieri di pazienti affetti da SLA al fine di individuare un disegno di marcatura specifico. Il metodo utilizzato riguarda lo screening di anticorpi anti sistema nervoso basato su un’analisi immunoistochimica (IHC) semi quantitativa (metodo TABA) su sezioni di cervello di ratto al fine di descrivere e quantificare la reattività contro particolari regioni del cervello (Boscolo et al. 2007) e di discriminare le specifiche marcature associate alle differenti neuropatologie. L’innovazione di questa ricerca è stato quello di creare un metodo di controllo qualità per il saggio di analisi immunoistochimica mediante l’ideazione di un protocollo standard che si avvale dell’utilizzo di un controllo positivo (siero a reattività nota), la cui stabilità viene monitorata nel tempo tramite l’utilizzo di un algoritmo statistico. E’ stato scelto all’interno della sieroteca presente in laboratorio, un siero fortemente positivo all’analisi TABA e sono state marcate 80 sezioni di cervello con questo anticorpo. E’ stata quindi eseguita la densitometrie su 3 aree cerebrali: il midollo allungato, il V° strato della corteccia e le cellule del Purkinjie. Quindi è stato possibile definire un intervallo di confidenza densitometrico per standardizzare l’uso dell’ IHC, da utlizzare come protocollo di controllo qualità. L’identificazione di un metodo di controllo qualità per l’analisi immunoistochimica rappresenta un grande passo avanti nella diagnostica di laboratorio in quanto permette la standardizazzione di un metodo da molti sottovalutato ma indispensabile nell’identificare la reattività di un siero verso antigeni ignoti, nel caso in cui i kit attualmente in uso non ne identifichino l’antigene. Infine, grazie al confronto tra la diagnosi basata sul metodo TABA e i kit diagnostici è stato possibile valutare i parametri qualitativi del metodo TABA in termini di predittività e specificità. La seconda parte di questo lavoro è focalizzata allo sviluppo di un test che permetta l’analisi della reattività dei sieri di pazienti che presentano neuropatie non ancora classificate perché ad antigene ignoto. Attualmente in commercio esistono kit diagnostici per l’individuazione degli antigeni target delle neuropatie periferiche, tuttavia il numero di neuropatie autoimmuni non identificate è ancora alto. Pertanto abbiamo deciso di sfruttare la tecnica dell’IHC su nervo sciatico di ratto per individuare la presenza di un’autoimmunità nel caso in cui i kit commerciali risultino negativi. Questo studio prevede l’analisi di 25 sieri di pazienti affetti da neuropatie e il successivo confronto tra i vari protocolli al fine di individuare un metodo per l’analisi immunoistochimica su nervo sciatico di ratto utilizzando anticorpi secondari specifici anti IgG ed IgM umane. E’ stato effettuato quindi uno studio in relazione ai diversi disegni di marcatura delle sezioni, al fine di trovare una correlazione tra la patologia e il pattern di marcatura (sugli assoni, sull’endonevrio ed un pattern misto). I risultati ottenuti con questo nuovo approccio “home made” sono stati in seguito paragonati con quelli riscontrati utilizzando un kit diagnostco commerciale Euroimmun Italia. Tuttavia, la metodica di IHC non è risultata in nessun caso idonea per la rilevazione di autoanticorpi IgG o IgM nelle neuropatie periferiche. Paralellamente è stato svolto uno studio riguardante un gruppo di pazienti afferri da sclerosi laterale amiotrofica (SLA), per cui vi sono evidenze di una possibile componente autoimmune (Pagani et al. 2006). Sono stati analizzati 14 sieri di pazienti con confermata diagnosi di SLA e 9 sono risultati positivi all’esame immunoistochmico TABA per le IgG di cui 2 erano positivi kit per autoanticorpi paraneoplastici. Pertanto in 7 pazienti, si è riscontrata una reazione anti-neurale non spiegata da anticorpi noti. E’ stato possibile inoltre identificare un pattern di marcatura comune nei sieri affetti da SLA che corrisponde ad una marcatura del nucleolo (Parker et al. 2009). Quattro di questi sieri sono risultati positivi per l’antigene Ro52 con il metodo line blot. Questi risultati supportano l’ipotesi autoimmune nella SLA e confermano l’uso della IHC con il metodo TABA come con importante strumento di diagnosi e di ricerca di nuovi autoanticorpi.
PhD cycle: XXIV Ciclo
PhD programme: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NEUROSCIENZE E SCIENZE COGNITIVE - indirizzo NEUROBIOLOGIA
Description: 2010/2011
Keywords: autommiunità autoanticorpi neuropatie SLA sistema nervoso
Main language of document: it
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/06 ANATOMIA COMPARATA E CITOLOGIA
NBN: urn:nbn:it:units-4426
Appears in Collections:Scienze biologiche

Files in This Item:

File Description SizeFormat
Zulian_phd.pdf27.08 MBAdobe PDFView/Open
View Statistics

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.