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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/7859

Title: Molecular insights for overcoming Hepatocellular Carcinoma
Authors: Pascut, Devis
Supervisor/Tutor: Tiribelli, Claudio
Issue Date: 24-Apr-2012
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: SUMMARY Introduction. Hepatocellular Carcinoma (HCC) ranks fifth in frequency of cancers in the world. Orthotopic Liver Transplantation (OLT) or liver resection represents the best treatments for HCC. However, most patients cannot be subjected to potential curative OLT or resection because of extensive tumor involvement of the liver, metastasis, invasion of the portal vein or advanced underlying hepatocellular disease at the time of diagnosis. Systemic chemotherapy or chemoembolization represent a good alternative for the treatment, however drug therapy of cancer in general is hampered by multidrug resistance (MDR) that is a phenomenon caused by the up-regulation of the ABC-transporters (ABC) leading to chemotherapy failure. To overcome these problems new therapeutic approaches, such gene therapy, are needed. Selective down-regulation of an essential and specific cancer gene such as telomerase (hTERT) could represent an emerging strategy that could prevent cancer progression and diminish numerous side effects derived from drug usage. The present study include two tasks whose aims are: Task 1: a) Assess if the extent of tumoral differentiation results in a different ABCB1, ABCC1 and ABCG2 expression. b) Assess whether the treatment with a chemotherapeutic drug(s) may affect the expression of the three ABC transporters under study. Task 2: To overcome the obstacle of MDR-induced chemoresistance using new therapeutic approaches such as gene therapy, silencing a cancer essential and specific gene. Results and discussion. Task 1: We assessed the ABCB1, ABCC1 and ABCG2 expression in three hepatic cell lines: IHH (non tumoral control), HuH7 (differentiated tumoral cells) and JHH6 (undifferentiated tumoral cells). Only ABCG2 expression correlates with the degree of tumoral differentiation. Through confocal microscopy analysis we observed that the Doxorubicin (Dox) is able to reach the cell’s nucleus within 10 min. After 24h and 48h Dox is completely concentrated into the nucleus where some nuclear damage occurs. The presence of damaged nuclei could explain the decreased mRNA in most of the ABCs under study. The treatment with Dox doses lower than the LC50 for 24h and 48h has different consequences for all the ABC considered in the three cell lines, with an mRNA expression pattern not in line with the protein one in most of the cases, suggesting that the possible mechanism that determines the ABCs protein upregulation in the tumoral cell lines (HuH7 and JHH6) is not the de-novo transcription but probably something related to the protein turnover. After the treatment ABCC1 protein expression increases in the tumoral cell lines but not in the non tumoral one (IHH). Regarding ABCB1 and ABCG2, these transporters seem to play a role only in HuH7 and JHH6 cells respectively. We were not able to correlate the tumorigenic potential of the two tumoral cell lines with the ABC expression since the different behaviour of ABCs and the different contribution to MDR. Thus in order to better clarify the contribution of each single ABC to MDR our future steps will consider the use specific inhibitors. Task 2: From our in vivo data, among four cancer related genes we selected hTERT as the best candidate for silencing experiments due to its exclusive expression in tumoral samples. A functional non-inflammatory siRNA targeting hTERT was designed: SirTel 1. Silencing experiments were conducted in JHH6 cell line. The hTERT silencing effect was dose dependent, at least at the three considered doses (25-50-100nM). For all the subsequent determinations the experimental concentration was 25nM. After 72h of silencing we observed a significant reduction in both hTERT mRNA expression and enzymatic activity (p<0.001). The effects observed in the cells after silencing are: - Morphological changes, from a fibroblast-like to an hepatocyte-like shape; - Increased albumin expression. The expression of this hepatic hallmark increases after silencing in JHH6 cells that, due to their poor degree of differentiation, at basal conditions do not express quantifiable levels of albumin. The peak of the higher albumin expression corresponds to the maximum hTERT silencing effect. - Decreased cell viability (p<0.01). Interestingly, the siRNA induced a reduction in cell viability higher than Dox. - Cell cycle arrest in G1 phase (p<0.01). All data were validated using a hTERT negative cell line (primary culture of human fibroblast). After 72h silencing, we observed that hTERT expression reaches its minimum, and the expression is recovered after 264h although it does not reach the initial expression levels. Re-exposing the cells to additional 25nM of siRNA induces a reduction of mRNA levels by 76% compared to the amount already present after the first treatment. Taken together all this results suggest the pivotal role of hTERT silencing in a HCC derived cell line. Therefore, hTERT represent a promising candidate for gene-therapy strategies in HCC.
RIASSUNTO Introduzione. Il carcinoma epatico occupa il quinto posto per incidenza tra i diversi tipi di tumore a livello mondiale. Il trapianto di fegato o la resezione epatica rappresentano le terapie d’elezione per questo tipo di tumore, tuttavia molti dei pazienti non possono essere sottoposti a questo tipo di interventi visti l’estensione del tumore nell’organo, la presenza di metastasi, l’invasione portale e la presenza di altre disfunzioni epatiche al momento della diagnosi. La chemioterapia sistemica o la chemioembolizzazione rappresentano una valida alternativa per il trattamento della patologia, tuttavia l’utilizzo di farmaci chemioterapici può portare all’insorgenza di chemioresistenza (multidrug resi stance, MDR) determinando l’inefficacia del trattamento. Parte attiva del fenomeno della chemioresistenza è rappresentato dai trasportatori ACB che sono coinvolti nell’espulsione del farmaco dalla cellula, di fatto impedendone l’azione. Lo sviluppo di nuove terapie geniche potrebbe sostituire l’utilizzo di farmaci per il trattamento del tumore. L’inibizione selettiva di componenti essenziali e specifici per le cellule tumorali come lo è la Telomerasi può rappresentare una strategia emergente che potrebbe prevenire la progressione tumorale ed evitare l’insorgenza dei numerosi effetti collaterali che derivano dalla correnti terapie farmacologiche. Il presente studio comprende due task i cui obbiettivi sono i seguenti: Task 1: a) valutare se il diverso grado di differenziamento tumorale corrisponde ad una diversa espressione dei trasportatori ABCB1, ABCC1 e ABCG2. b) valutare se il trattamento farmacologico influisce sull’espressione dei trasportatori ABC analizzati in questo studio. Task 2: sviluppo di nuovi approcci terapeutici basati sulla terapia genica. Risultati e Discussion. Task 1: è stata valutata l’espressione di mRNA dei trasportatori ABCB1, ABCC1 e ABCG2 in tre linee cellulari epatiche: IHH (cellule epatiche immortalizzate, il controllo non tumorale), HuH7 (cellule tumorali differenziate) e JHH6 (cellule tumorali scarsamente differenziate). ABCB1 è il principale ABC espresso nelle Huh7 e solamente l’espressione di ABCG2 correla col grado di differenziamento tumorale delle cellule. Tramite l’utilizzo della microscopia confocale è stata osservata la capacità della Doxorubicina (Dox), uno tra i più utilizzati farmaci antineoplastici, di raggiungere il nucleo delle cellule entro 10 min dalla somministrazione. Trascorse 24h la Dox è totalmente localizzata all’interno del nucleo causando la morte delle cellule più sensibili. A 48h sono evidenti i danni nucleari e cellulari nelle cellule sopravissute. Il trattamento con dosi di Dox inferiori alla LC50 per 24h e 48h ha diverse conseguenze sull’espressione dei tre trasportatori nelle diverse linee cellulari studiate. In particolare in molti casi l’espressione di mRNA non correla con l’espressione proteica suggerendo che, in questi casi, la regolazione sia dovuta a fenomeni di diminuito turnover proteico piuttosto che di nuova sintesi. A seguito del trattamento con il farmaco, l’espressione di ABCC1 aumenta nelle sole linee cellulari tumorali (Huh7 e JHH6). ABCG2 sembra avere un ruolo rilevante nelle sole cellule JHH6 mentre ABCB1 è espresso unicamente nelle HuH7 dove vi è un aumento dell’espressione proteica a seguito di trattamenti con la Dox. In questo studio non è stato possibile correlare il potenziale tumorigenico delle linee cellulari con l’espressione degli ABC visto il loro peculiare profilo di espressione ed il loro diverso contributo nella chemioresistenza. Per questi motivi in futuro ci si propone di trattare le cellule con inibitori specifici per ciascun ABC al fine di meglio comprendere i loro diversi ruoli nell’insorgenza della resistenza alla Dox. Task 2: Da studi condotti in vivo, il gene della subunità catalitica della Telomerasi (hTERT) è stato selezionato per gli esperimenti di silenziamento genico vista la sua esclusiva espressione nei tessuti tumorali. Tramite analisi bioinformatiche è stato disegnato un siRNA anti-hTERT (SirTel 1) capace di evitare l’induzione di infiammazione nelle cellule che lo internalizzano. Gli esperimenti di silenziamento sono stati effettuati nella linea cellulare JHH6. Dopo 72h di silenziamento con 25nM di SirTel 1 si è osservata una riduzione significativa nell’espressione di hTERT e nella sua attività enzimatica (p<0,001). Gli effetti del silenziamento di hTERT riscontrati sono i seguenti: - Cambiamenti morfologici delle cellule silenziate le quali passano dall’avere un forma fibroblasto-simile ad una forma epatocita-simile. - Aumento dell’espressione di albumina, un marker epatocitario, il cui picco di espressione corrisponde al massimo effetto di silenziamento. - Diminuzione della vitalità cellulare (p<0,01). SirTel 1 risulta più efficace nel ridurre la vitalità cellulare della Dox, il farmaco antineoplastico più utilizzato nelle terapie tumorali. - Arresto del ciclo cellulare nella fase G1 (p<0,01). Tutti i risultati sono stati validati utilizzando cellule hTERT negative come i fibroblasti primari. Il silenziamento raggiunge i suoi massimi livelli trascorse le 72h dalla trasfezione e l’espressione della Telomerasi sembra ritornare ai livelli iniziali attorno alle 264h dalla iniziale somministrazione. La riesposizione con una seconda dose di siRNA riduce ancor più l’espressione di hTERT portandola a circa il 20% dell’espressione iniziale (p<0,001). Questi risultati dimostrano il ruolo fondamentale della Telomerasi per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule tumorali epatiche. Per questi motivi hTERT costituisce un candidato promettente per le future terapie geniche applicate all’HCC.
PhD cycle: XXIV Ciclo
PhD programme: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
Description: 2010/2011
Keywords: HCC
ABC transporters
Telomerase
silencing
gene therapy
Main language of document: en
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/11 BIOLOGIA MOLECOLARE
NBN: urn:nbn:it:units-4461
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