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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/7863

Title: Is bilirubin able to affect the cell cycle in Gunn rat brain? - An in vivo and in vitro study -
Other Titles: Is bilirubin able to affect the cell cycle in Gunn rat brain? -An in vivo and in vitro study-
Authors: Robert, Maria Celeste
Supervisor/Tutor: Tiribelli, Claudio
Co-supervisor: Gazzin, Silvia
Issue Date: 24-Apr-2012
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: The hyperbilirubinemic jj Gunn rat is a well established animal model for Crigler-Najjar type I Syndrome and neonatal jaundice. Similarly to humans, they present neurological deficits and what is more a marked cerebellar hypoplasia with a prominent loss and degeneration of Purkinje cells and granule neurons. Since high levels of bilirubin have been proven to arrest the cell cycle progression, we addressed the question if the cerebellar hypoplasia observed in the hyperbilirubinemic Gunn rat could be somehow linked to a cell cycle arrest, and if this cell cycle arrest was affecting selectively primary cultures of astrocytes and cerebellar granule neurons. In the in vivo study we report that the high levels of bilirubin present in the cerebellum of hyperbilirubinemic Gunn rat cause a cell cycle arrest in the late G0/G1 phase, characterized by a decrease in the protein expression of Cyclin D1, Cyclin A, Cyclin A1 and most importantly Cdk2. Meanwhile an increase in protein expression of total Cyclin E, due to a rose in the levels of low molecular weight Cyclin E forms (a supposed attempt to bypass the cell cycle arrest), was in vain. Furthermore, we observed an increment in the 18 kDa fragment of Cyclin E (implicated in the amplification of the apoptotic pathway) suggesting us the presence of an increased apoptosis. Consistent with this speculation, the levels of the cleaved form of Poly (ADP-ribose) Polymerase (PARP-1) were increased. In the in vitro study we support the selectivity of bilirubin to damage specific cells as cerebellar granule neurons. Cerebellar granule cells viability was more affected respect to astrocytes in the same treatment conditions. The cell cycle was affected by high concentration of bilirubin only in cerebellar granule cells. We hypothesised that the characteristic cerebellar hypoplasia of hyperbilirubinemic Gunn rat may be due to the conjunction between cell cycle arrest and apoptosis, and that these two processes are intimately connected. Furthermore, only granule neurons cell cycle was affected. Cryopreservation has been used routinely in prolonged storage of many mammalian tissues. The cryopreservation of neural cells/ tissue started to be interesting after the successful transplantation of such tissues, mainly for research. Several studies have been performed to achieve cryopreservation of granule cells, however, for these cell types there is no defined protocol for cryopreservation with sufficient success to enable it to be incorporated into routine clinical practice. As we were thinking to perform cerebellar granule cells transplantation as a way to treat Gunn rats cerebellar hypoplasia, we started to set up a protocol for cerebellar granule cells cryopreservation using the slow-freezing methodology. Cerebellar granule cells were successfully cryopreserved with a protocol that involves the use of 10 % of DMSO as cryoprotective agent, a freezing rate of 2.1°C/min, and a fast (154.4°C/ min) rewarming at 39°C. The cells cryopreserved in this way had a good cell viability and were kept in culture for 7 days. More experiments have to be made to standardize this protocol.
Il ratto Gunn jj iperbilirubinemico è il modello animale stabilito per il Sindrome di Crigler- Najjar tipo I e il ittero neonatale. Allo stesso modo degli esseri umani, essi presentano deficit neurologici e in più una marcata ipoplasia cerebellare con un’importante perdita e degenerazione delle cellule di Purkinje e delle granulari. Poiché è stato dimostrato che alti livelli di bilirubina arrestano la progressione del ciclo cellulare, abbiamo valutato se l’ipoplasia cerebellare osservata nel ratto Gunn iperbilirubinemico possa essere in qualche modo legata ad un arresto del ciclo cellulare. Per discriminare se l’arresto del ciclo cellulare possa incidere selettivamente su diverse popolazioni cellulari che compongono il tessuto, sono state quindi prodotte e trattate con bilirubina delle colture primarie di astrociti e granulari dal cervelletto. Nello studio in vivo abbiamo rilevato che i livelli elevati di bilirubina presenti nel cervelletto dei ratti Gunn iperbilirubinemici causano un arresto del ciclo cellulare nella fase tardiva G0/ G1, caratterizzata da una diminuzione dell’espressione proteica della Ciclina D1, Ciclina A, Cyclina A1 e soprattutto di Cdk2. Al contrario, abbiamo osservato un aumento dell’espressione proteica della Ciclina E totale. Tale aumento è legato, tuttavia, ad una maggiore espressione delle forme a basso peso molecolare della Ciclina E, note per la loro capacità di attivare e quindi far progredire più rapidamente il ciclo cellulare. Tale effetto non è però presente nel cervelletto del ratto Gunn, come confermato tramite l’analisi del ciclo cellulare eseguita al FACS, che conferma un aumento dell’arresto nella fase tardiva G0/ G1. In aggiunta, abbiamo osservato un incremento nel frammento di 18 kDa della Ciclina E (implicato nella amplificazione della via apoptotica) suggerendo la possibilità di un effetto amplificativo dell’apoptosi. In accordo con questa ipotesi, abbiamo osservato incrementi importanti della forma clivata della Poly (ADP-ribosio) Polimerasi (PARP-1), marker di apoptosi. Nello studio in vitro abbiamo dimostrato un danno selettivo della bilirubina sui neuroni (coltura primaria di granulari) del cervelletto, con una maggiore e più precoce riduzione della vitalità dopo esposizione a bilirubina rispetto alle colture primarie di astrociti dallo stesso 2 tessuto. In aggiunta, abbiamo rilevato come il ciclo cellulare sia stato influenzato (aumento del numero di cellule in G0/ G1) solo nelle cellule granulari. In conseguenza abbiamo ipotizzato che la caratteristica ipoplasia cerebellare osservata nel ratto Gunn iperbilirubinemico può essere dovuta alla congiunzione tra arresto del ciclo cellulare e apoptosi, e che questi due processi sono intimamente connessi attraverso il frammento p18 della Ciclina E. Poiché in vitro le sole granulari hanno subito una perturbazione del ciclo cellulare, è ipotizzabile che l’aumento delle cellule arrestate in tarda G0/G1 osservato in vivo, sia dovuto preferenzialmente all’effetto del pigmento sui neuroni piuttosto che sulla glia. La crioconservazione cellulare è stata utilizzata di routine nello stoccaggio prolungato di molti tessuti di mammiferi. La crioconservazione di cellule/ tessuti neuronali ha iniziato ad acquisire interesse dopo il successo nel trapianto di tali tessuti. Diversi studi sono già stati compiuti per crioconservare cellule granulari, tuttavia, non esiste ancora un protocollo che garantisca una sufficiente efficienza da permettere di essere utilizzato nella pratica clinica. Nell’ipotesi di effettuare il trapianto di cellule granulari di cervelletto come trattamento per la ipoplasia cerebellare osservate nei ratti Gunn, abbiamo iniziato a stabilire un protocollo per la crioconservazione di tali cellule usando la metodologia di congelamento lento (slow freezing). Cellule granulari cerebellari sono state crioconservate con successo con un protocollo che comporta l’uso di 10% DMSO come agente crioprotettivo, una velocità di congelamento di 2.1°C/ min, e un riscaldamento veloce (154.4°C/ min) a 39°C. Le cellule crioconservate con questo protocollo hanno mantenuto una buona vitalità dopo scongelamento, rimanendo vitali in coltura per 7 giorni. Ulteriori esperimenti devono essere effettuate per standardizzare questo protocollo.
PhD cycle: XXIV Ciclo
PhD programme: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
Description: 2010/2011
Keywords: Hyperbilirubinemia
Gunn rat
Hypoplasia cerebellar
Cell cycle
Main language of document: en
Type: Tesi di dottorato
Doctoral Thesis
Scientific-educational field: BIO/11 BIOLOGIA MOLECOLARE
NBN: urn:nbn:it:units-4465
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