Scienze biologiche

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a lethal neurodegenerative disease characterized by loss of motoneurons. The discovery of mutations in the gene for the cytosolic Cu/Zn superoxide dismutase in a small proportion of familiar ALS patients led to an animal model in which the human mutant SOD1 is overexpressed in mice (G93A). For this study, we employed the long term spinal cord organotypic cultures developed from G93A embryonic mice and their wild type (WT) littermates, starting from the recent findings emerged from a study by Avossa et al. (2006). These authors reported that G93A organotypic spinal cultures exhibited increased vulnerability to AMPA glutamate receptormediated excitotoxic stress, prior to clear disease appearance, besides showing a significantly increased ratio between inhibitory and excitatory synapses, although they did not express evident morphological differences, when compared to WT ones (Avossa et al., 2006). The primary objective of this study was to investigate this early ALS stage to understand how functional changes can predate morphological alterations. To that aim we monitored spontaneous synaptic activity via patch clamping interneurons both in WT and G93A spinal cultures after 7, 14 and 21 days of in vitro (DIV) growth. At 7 DIV, when synchronous episodes of activity are normally detected in cultured spinal circuits, G93A slices displayed bursting with a higher probability (83%) when compared to controls (54%). Between 14 and 21 DIV, when bursting activity disappear, both in G93A and WT slices, pharmacological dissection of glutamate, GABA and glycine mediated post synaptic currents (PSCs), showed, in G93A, a significant reduction in GABAergic PSCs and mPSCs in respect to WT. Upon pharmacological removal of the GABAergic component, fast glycinergic events were unmasked and these events displayed a similar frequency in both culture groups. Along with in vitro growth, we detected a progressive reduction in the decay time constant of glycinergic PSCs, such process was significantly faster in G93A. Thus, a shift in dynamic communication within spinal networks might be involved in ALS progression.

During the development of spinal cord, the maturation of neuronal circuits is a complex process, involving genetic and epigenetic mechanisms cooperating for the maturation of motor control (Jessell, 2000; Kiehn, 2006). Variations in the concentration of intracellular Ca2+ are crucial signals in this process of maturation; in fact, Ca2+ signals may lead to the emergence of specific neuronal phenotypes or guide the formation of cellular connectivity. The organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord represent an ideal experimental approach to study the maturation and physiology of the individual neurons and spinal networks. In fact, this experimental model reproduces in vitro the heterogeneous populations of cells, the three dimensional connections between these cells and the basic cytoarchitecture of the spinal cord observed in in vivo development (Avossa et al., 2003). In this experimental model, three different types of Ca2+ activity have been identified and characterized: waves, bursts and oscillations (Fabbro et al., 2007; Sibilla et al., 2009). These Ca2+ signals are all generated by ventral interneurons, but each of them shows a specific pattern of expression during development and has different underlying mechanisms. In this thesis, I focused my attention on the most peculiar of these Ca2+ signals: the electrical activity-independent Ca2+ oscillations. The main aim of my thesis was to better clarify the mechanisms underlying the generation and role of Ca2+ oscillations in spinal neurons, by investigating the effects of pharmacological manipulation of intracellular Ca2+ buffering on Ca2+ oscillations behavior, neuronal biophysical properties and neuronal network activity in organotypic spinal cultures. To this aim, I treated spinal cord slices with two different intracellular Ca2+ buffers, BAPTA-AM and EGTA-AM, and I monitored their impact using both Ca2+-imaging and single cell patch-clamp techniques. Initially, I investigated the effects on Ca2+ oscillations induced by both chronic and acute treatment with BAPTA-AM. For the first time I described a change in the activity of oscillating neurons. In particular, after chronic incubation with BAPTA-AM, I reported a significant increase in the number of neurons recruited to generate Ca2+ oscillations, which was accompanied by a modulation of oscillations kinetic. Ca2+ oscillations recorded after chronic incubation with BAPTA-AM maintained their peculiar features (Fabbro et al., 2007; Sibilla et al., 2009), in particular their Ca2+-dependence, thus supporting the idea that the BAPTA-induced oscillations represent an amplification of the true oscillations phenomena, amplified by a prolonged intracellular Ca2+ buffering. Despite a potentiating effect of chronic BAPTA-AM treatment on Ca2+ oscillations, its acute application completely blocked Ca2+ oscillations in all neurons. The next step was to verify whether the observed effects could be related to changes in the biophysical properties of neurons or in neuronal network electrical activity. By patch clamp experiments I showed that the chronic BAPTA-AM treatment induces a significant enhancement in the frequency of heterogeneous (GABA-glycine and AMPA mediated) spontaneous post-synaptic currents (PSCs) when compared to untreated cultures. Neuronal membrane capacitance and input resistance were comparable to those of control neurons, thus confirming neuronal health. As the reported results pointed to an increased excitability at the level of single neuron, I analyzed the impact of BAPTA treatment on the functional expression of a family of channels extremely important in the regulation of neuronal excitability: voltage-gated K+ channels. I observed the presence of a significant increase in the amplitude of K+ currents (IK) in slices chronically treated with BAPTA-AM. To analyze the type of IK involved I separated the different IK components (Ca2+-dependent -IK(Ca)- , transient -IK(A)- and delayed-rectifier -IK(DR)-), demonstrating that, in BAPTA-AM treated cultures, the IK(Ca) and IK(A) components were similar to control cultures. Conversely, I found a potentiation of IK(DR), i.e. an increase in its maximal current amplitude. Furthermore, I found that acute application of BAPTA-AM partially reduces the magnitude of total IK. Action potentials are other critical players reflecting neuronal excitability. Chronic BAPTA-AM treatment did not affect action potential kinetic; however, I found that BAPTA-treated neurons show a different distribution profile of excitability, with a widening of the population of ventral spinal interneurons displaying a tonic firing pattern and a decrease in the one showing an adapting firing behavior. To explore the specificity of BAPTA-AM effects I employed another intracellular Ca2+ chelator: EGTA-AM. I reported, as a consequence of a chronic EGTA-AM treatment of spinal neurons, an increase in the population of oscillating neurons (similarly to BAPTA treatment), but, without changes in oscillations kinetic. However, the study of synaptic activity in EGTA-AM treated slices did not reveal any change in the frequency or kinetic of spontaneous or miniature PSCs. Interestingly, in contrast to BAPTA treatment, EGTA-AM had no effect on IK. Overall, the results reported in this thesis show, on one hand, a specific effect of BAPTA-AM on K+; most importantly, on the other hand, they support the needing of a correct intracellular Ca2+ homeostasis for the genesis of Ca2+ oscillations and indicate the presence of a homeostatic adaptation as a rebound effect of chronic manipulation of intracellular Ca2+.

My PhD project concerns neurodegenerative processes in the mouse spinal cord, with a particular attention to amyotrophic lateral sclerosis (ALS). During my PhD I have used as a model the organotypic spinal slice cultures and I have focused my studies on: early changes in spinal tissue excitability in an ALS genetic model; spinal network activity changes induced by oxidative stress in wild type (WT) and synaptic activity in premotor circuits when challenged by neuroinflammation in WT. The principal aim of my work was to understand the dialogue between a general stress condition and the spinal premotor network. To this aim, I combined electrophysiological techniques and immunofluorescence analysis to characterized the ventral interneurones located in spinal microcircuits. For that purpose I exploited the organotypic cultures developed from embryonic mouse spinal cord that are generally accepted as a good model to study the neuronal premotor activity and provide high experimental access to interneurones (Avossa et al., 2003). In the first part of my research I compared WT cultures with SOD1G93A transgenic cultures, one of the more investigated ALS model. In cultured spinal networks, as described in acute preparation collected at different stages of development, there is a progressive fastening of glycinergic currents, represented by the reduction of the decay time constant (tau value) of synaptic currents along with the slices growth. WT and SOD1G93A cultures display a different maturation profile since in transgenic slices this developmental process is significantly steeper not only in glycinergic post synaptic currents (PSCs) but also in miniature PSCs (mPSCs). This difference in the glycinergic PSCs kinetic properties can be strongly reduced by the presence of TBOA that lowers the GABA synthesis. These results support the hypothesis that in SOD1G93A cultures there is an increase amount of glycine and GABA co-release leading to the conclusion that the synaptic release is conditioned by the presence of the mutation at an early stage of development, before any evident neuronal degeneration. Moreover, I supported this data also with preliminary results regarding the co-staining of GlyT2 and GAD65 (markers for presynaptic glycine and GABA, respectively). In fact, SOD1G93A spinal organotypic slices seem to display an higher amount of mixed synapses. Next, I tested other stress processes of the tissue that could potentially affect synaptic activity and, ultimately, alter network activity. I tested chronic incubations of the spinal slices, since they are long-term preparations, with stress key players: hydrogen peroxide (H2O2) to create an oxidative stress and lipopolysaccharide (LPS) or a mixture of cytokines (CKs: TNF-α, IL-1β and GM-CSF) to mimic neuroinflammation. For these sets of experiments I have used another strain of mice with no genetic manipulation. All these chronic treatments increase the AMPA receptor mediated PSCs frequency; moreover, a neuroinflammation state is able to enhance the overall network activity; LPS treatment increases also the amplitude of AMPA-mediated synaptic currents in both spontaneous and miniature events, while CKs accelerate the disinhibited burst rhythm induced by the pharmacological removal of the synaptic inhibition that switch on the rhythmogenic centre contained in the spinal network. Summarizing, I detected that the treatments with these environmental cues affected the synaptic component, in this case the excitatory one, of the premotor network. Altogether, my work highlighted that a genetic predisposition (in the case of familial ALS) and environmental factors of different kind (oxidative and inflammatory factors or an alterate SOD1) trigger changes in synaptic transmission and we may speculate that these alterations in the premotor circuit could cooperate in synergy leading to the development of misconnected networks that contribute to induce motoneuronal neurodegeneration. Riassunto Il mio progetto di dottorato riguarda processi neurodegenerativi del midollo spinale, con una particolare attenzione verso la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Durante il mio dottorato ho usato come modello le fettine organotipiche di midollo spinale e ho concentrato i miei studi su: cambiamenti precoci nell’eccitabilità del tessuto spinale in un modello genetico di SLA; cambiamenti nell’attività del network spinale indotti da stress ossidativo in wild type (WT) e cambiamenti nell’attività sinaptica dei circuiti premotori sottoposti ad uno stress infiammatorio in WT. Il fine principale del mio lavoro era quello di capire il dialogo tra una condizione di stress generale ad il network spinale premotorio. A questo scopo, ho unito tecniche elettrofisiologiche e analisi di immunofluorescenza per caratterizzare gli interneuroni ventrali localizzati nel microcircuito spinale. Per raggiungere questo obiettivo ho sfruttato le colture organotipiche derivate dal midollo spinale di embrioni di topo che sono generalmente accettate come un buon modello per studiare l’attività premotoria neuronale e garantiscono un facile accesso sperimentale agli interneuroni (Avossa et al., 2003). Nella prima parte della mia ricerca ho confrontato colture WT con colture transgeniche SOD1G93A, uno dei modelli di SLA maggiormente studiati. Nei network spinali in coltura, come già descritto in preparazioni acute ottenute a diversi stadi di sviluppo, c’è una progressiva velocizzazione delle correnti glicinergiche, rappresentata dalla riduzione del decay time constant (valore di tau) delle correnti sinaptiche durante la crescita delle fettine. Le colture WT e SOD1G93A presentano un diverso profilo di maturazione dato che nelle colture transgeniche questo processo di sviluppo è significativamente più marcato non solo nelle correnti postsinaptiche (PSCs) ma anche negli eventi in miniatura (mPSCs). Questa differenza nelle proprietà cinetiche delle correnti glicinergiche può essere fortemente ridotta dalla presenza di TBOA che diminuisce la sintesi del GABA. Questi risultati supportano l’ipotesi che nelle colture SOD1G93A ci sia un aumento del co-rilascio GABA/glicina portando alla conclusione che il rilascio sinaptico sia condizionato dalla presenza della mutazione ad uno stadio precoce dello sviluppo, prima di qualsiasi degenerazione neuronale evidente. Inoltre, ho supportato questo dato anche con risultati preliminari riguardanti la marcatura di GlyT2 e GAD65 (due marker per la glicina ed il GABA presinaptici rispettivamente). Infatti, le fettine spinali organotipiche SOD1G93A sembrano caratterizzate da un aumento delle sinapsi miste. Successivamente, ho testato altri processi di stress del tessuto che potrebbero interferire con l’attività sinaptica e, conseguentemente, alterare l’attività del network. Dato che le fettine spinali sono preparazioni a lungo termine, ho testato incubazioni croniche con molecole chiave nei processi di stress: perossido di idrogeno (H2O2) per creare uno stress ossidativo e lipopolisaccaride (LPS) o una miscela di citochine (CKs: TNF-α, IL-1β and GM-CSF) per mimare uno stato infiammatorio. Per questo set di esperimenti ho usato un altro ceppo di topi privo di manipolazione genetica. Tutti questi trattamenti cronici aumentano la frequenza delle correnti mediate dai recettori AMPA; inoltre, uno stato infiammatorio è in grado di incrementare l’attività globale del network; il trattamento con LPS aumenta anche l’ampiezza delle correnti sinaptiche AMPA-mediate, sia spontanee che in miniatura, mentre le CKs accelerano il ritmo dei burst indotto dall’eliminazione farmacologica dell’inibizione sinaptica che accende il centro ritmogenico presente nel network spinale. Riassumendo, ho dimostrato che i trattamenti con questi fattori ambientali alterano la componente sinaptica, in questo caso eccitatoria, del network premotorio. Nel complesso il mio lavoro ha evidenziato che una predisposizione genetica (nel caso della SLA familiare) e fattori ambientali di varia natura (ossidativi, infiammatori o di alterata SOD1) inducono cambiamenti nella trasmissione sinaptica e possiamo speculare sul fatto che queste alterazioni nel circuito premotorio possono cooperare in sinergia causando lo sviluppo di network inefficienti che concorrono a determinare la neurodegenerazione motoneuronale.

Col termine generale di “plasticità sinaptica” si intendono tutti i meccanismi che stanno alla base della capacità del sistema nervoso di plasmarsi a seguito della sua maturazione e a fronte di stimoli esterni. Variazioni nella forma e nelle dimensioni oltre che l’instaurazione di nuove sinapsi o l’eliminazione di altre (sinaptogenesi) sono i meccanismi che regolano la plasticità sinaptica. Il sistema nervoso centrale è in grado di mettere in atto fenomeni di plasticità sinaptica in grado di modificarne la struttura e la funzionalità sia a corto che a lungo termine. Uno dei più studiati meccanismi cellulari alla base della memoria e dell’apprendimento è il potenziamento a lungo termine (Long Term Potentiation – LTP), una forma di plasticità neuronale che porta a un incremento dell’efficienza della trasmissione sinaptica durevole nel tempo. A livello cellulare, l’LTP aumenta la capacità di due neuroni di comunicare attraverso le sinapsi. Il meccanismo molecolare alla base di tale aumento dell’efficienza della trasmissione sinaptica non è univocamente stabilito, questo in parte è dovuto al fatto che l’LTP è determinato da diversi meccanismi che variano in base alla specie e alla regione del cervello in cui viene indotto. Una volta innescato, l’LTP conduce a varie modificazioni postsinaptiche, tra cui sintesi di nuovi recettori, nascita di nuove sinapsi (in particolare a livello del recettore glutamatergico NMDA) e cambiamenti a livello delle spine dendritiche (Engert and Bonhoeffer, 1999). Ragionevolmente, per indurre potenziamento a lungo termine è necessario che la membrana postsinaptica sia depolarizzata nell’intervallo di tempo in cui il terminale presinaptico libera glutammato: la depolarizzazione rimuove il blocco degli ioni magnesio dai recettori NMDA consentendo il passaggio (oltre al sodio e al potassio) anche agli ioni calcio. Il calcio è l'elemento centrale del processo perché, una volta raggiunta una certa concentrazione nella cellula, è in grado di attivare un processo per cui i recettori AMPA presenti nella cellula vengono trasferiti sulla membrana e i recettori già presenti lasciano passare una maggiore quantità di ioni. La sinapsi risulta così rinforzata. Questa condizione è stata sperimentalmente dimostrata su campioni di fettine di ippocampo usando una stimolazione elettrica (tetanica) (Nishi et al., 2001). Dopo la stimolazione tetanica, il neurone bersaglio rafforzato dall’LTP è molto più responsivo e produce un aumento dell’ampiezza delle correnti eccitatorie post-sinaptiche (Excitatory Post Synaptic Currents – EPSC) che perdura nel tempo. Questo comportamento trova spiegazione in una modificazione delle spine dendritiche sia nella forma, sia nel numero e dimensione. L’attività del mio dottorato di ricerca è stata condotta nell’ambito del progetto NanoMosquito, il cui scopo prinicipale consiste nell’indurre fenomeni di plasticità neuronale in cellule dissociate d’ippocampo di ratto e, successivamente, nel caratterizzare le mutazioni funzionali (tramite la tecnica elettrofisiologica del patch-clamping) e morfologiche, in scala micro e nanometrica, utilizzando tecniche quali la microscopia confocale e la microscopia a forza atomica (Atomic Force Microscopy – AFM). Diverse stimolazioni sono state testate per carcare di capire quali potessero indurre potenziamento della rete. Studi di plasticità vengono condotti in genere su fettine organotipiche, ma queste rendono impossibile studiare i cambiamenti che avvengono a livello delle spine dendritiche con tecniche in scala nanometrica, quali l’AFM. Diversi protocolli di stimolazione (treni a bassa frequenza, theta burst) sono stati utilizzati in esperimenti a doppio patch (due elettrodi usati in simultanea) su due cellule neuronali vicinali. Questo tipo di stimolazione ha portato però solo a un numero limitato di sinapsi potenziate e per questo motive abbiamo deciso di uitlizzare una particolare forma di plasticità sinaptica che prende il nome di Spike-Timing Dependent Plasticity (STDP). In questo tipo di plasticità il preciso ordine temporale tra i potenziali d’azione presinaptici e postsinaptici determina i cambiamenti che avverrano a livello della sinapsi stessa; per ottenere un potenziamento a livello del contatto sinaptico, il potenziale d’azione a livello postsinaptico deve seguire la depolarizzazione a livello presinaptico in una finestra temporale che va dai 5 ai 20 millisecondi (Bi and Poo, 1998). Anche in questo caso, monitorando successivamente l’ampiezza delle EPSCs, solo poche sinpasi andavano incontro a plasticità e il meccanismo che sta alla base di questo deve essere ancora determinato. Al contrario, il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), membro della famiglia delle neurotrofine e abbondantemente espresso nel sistema nervoso centrale (SNC), sta emergendo come un importante mediatore nella sopravvivenza, sviluppo e funzione dei neuroni (Lu, 2003). Colture embrionali dissociate di ippocampo sono state per la prima volta trattate cronicamente con BDNF promuovendo la formazione di nuove sinapsi, sia a livello eccitatorio che inibitorio, con conseguente aumento dell’attività spontanea dell’intera rete. Il BDNF inoltre si pensa induca modificazioni morfologiche sia nella complessità dell’albero dendritico che nel promuovere la crescita delle terminazioni assonali (Vicario-Abejon et al., 1998). Registrazioni elettrofisiologiche sono state effettuate per monitare l’attività spontanea della rete: nel dettaglio sono state misurate le EPSC e le IPSC tra neuroni incubati in BDNF e campioni di controllo mentre registrazioni doppie sono state effettuate per confrontare la percentuale di accoppiamento. Abbiamo così visto come il BDNF rafforzi l’attività sinaptica della rete e aumenti il numero di connessioni sinaptiche eccitatorie. Registrazioni paired-pulse ed esperimenti di imaging con FM1-43 hanno invece dimostrato come il BDNF induca anche delle modificazioni nella probabilità di rilascio vescicolare, in quanto, anche in questo caso l’ampiezza della risposta risulta aumentata nelle colture incubate. Marcando i neruoni (β-tubulin III) abbiamo visto anche come il BDNF aumenti la sopravvivenza neuronale, sopratutto a carico delle cellule piramidali, riconosciute dalla loro forma. Inoltre, eseprimenti condottti su cellule transfettate con cds-BDNF hanno confermato ulteriormente i nostril dati su come il BDNF aumenti la trasmissione sinpatica. La caratteristica comune di tutti questi diversi approcci è stata quella di indurre modifiche funzionali nelle connessioni sinaptiche eccitatorie. Successivamente l'induzione della plasticità sinaptica, la microscopia a scansione sarà utilizzata per seguire in tempo reale i cambiamenti morfologici delle sinapsi.

Nel midollo spinale lo sviluppo in circuiti funzionali delle reti neuronali dell’area ventrale è un processo complesso, che coinvolge meccanismi genetici ed epigenetici che promuovono la maturazione del controllo motorio (Jessell, 2000; Kiehn, 2006). Far luce su tali meccanismi è un passo cruciale per identificare quei neuroni che risultano essere più vulnerabili in caso di patologie degenerative del midollo spinale, ma anche per elaborare nuove strategie nel campo della rigenerazione dei circuiti danneggiati. Le colture organotipiche ottenute dal midollo spinale embrionale di topo e mantenute in vitro per 1 o 2 settimane, riepilogano molti dei processi che caratterizzano lo sviluppo dei segmenti spinali in vivo e sono particolarmente adatte allo studio della maturazione della rete spinale (Avossa et al., 2003; Rosato-Siri et al., 2004; Furlan et al., 2005; Furlan et al., 2007). In questa tesi ho usato tale modello per studiare, nei segmenti di midollo spinale embrionale, il controllo spazio-temporale di segnali intracellulari al Ca2+, generati da popolazioni neuronali appartenenti ai circuiti motori. Ho osservato la presenza di segnali ripetuti al Ca2+ dipendenti dall’età delle colture, monitorando le dinamiche intracellulari del Ca2+ nelle singole cellule con esperimenti di Ca2+-imaging in fettine precedentemente incubate con la sonda fluorescente FURA2-AM. Ho analizzato piccoli gruppi di interneuroni localizzati nella regione ventrale del midollo spinale, a stadi sia precoci che tardivi di sviluppo della rete, cioè a 7-11 (prima settimana) e 14-17 (seconda settimana) giorni in vitro (DIV; Furlan et al., 2007). Per la prima volta ho descritto un cambiamento nella generazione di segnali spontanei al Ca2+, dipendente dalla maturazione in vitro delle colture: da waves precoci, guidate dall’attività sinaptica, che invadevano l’intera regione ventrale del midollo spinale, fino a tardive oscillazioni asincrone, indipendenti dall’attività elettrica, generate da pochi neuroni ristretti alle aree ventrali. Mediante marcature di immunofluorescenza nonché con esperimenti di Ca2+- imaging, ho dimostrato che solo una minoranza (dal 15 al 20 %) di neuroni presenti nelle zone ventrali esprimevano questa tardiva attività oscillatoria. Queste oscillazioni mostravano una specifica dipendenza dalle proprietà di buffering del Ca2+ presenti a livello mitocondriale (Fabbro et al., 2007). In seguito, ho valutato il ruolo che le fonti extracellulari e intracellulari di Ca2+ potevano avere nella generazione di queste oscillazioni indipendenti dall’attività elettrica. Una prima idea del fatto che tali oscillazioni avessero un’origine complessa, Abstract 6 derivava dall’osservazione che nella maggior parte delle cellule (60%), questi segnali erano completamente bloccati in una soluzione priva di Ca2+, mentre nel 40% dei neuroni alcune oscillazioni persistevano anche in assenza di Ca2+. Questa risposta in una soluzione priva di Ca2+ è risultata essere bimodale, dal momento che non ho mai riscontrato alcuna coesistenza di questi due fenomeni nella stessa fettina. Una simile eterogeneità è stata osservata anche in seguito ad applicazioni di tapsigargina, la quale induceva sia il blocco (62% di neuroni) che la persistenza (38%) delle oscillazioni. Questa attività oscillatoria non dipendeva, però, dai depositi intracellulari di Ca2+ sensibili alla rianodina. Così, nonostante le proprietà stereotipate delle oscillazioni (origine, periodicità, etc…), questi eventi potrebbero essere generati grazie al contributo di diverse fonti di Ca2+. Una seconda questione importante nell’identificazione dei neuroni oscillanti è stata quella di monitorare i pattern di espressione delle Ca2+ binding proteins e dei trasportatori del Cl-, KCC2 e NKCC1. Ho osservato una forte dipendenza del profilo di espressione della proteina calbindina in relazione alla maturazione dei circuiti ventrali durante lo sviluppo. Questo non era, però, un fenomeno universale, infatti, altre Ca2+ binding proteins, come calretinina e parvalbumina, non avevano lo stesso profilo di espressione. Non ho, invece, riscontrato differenze nell’espressione della proteina NKCC1 tra 1 e 2 settimane in coltura; al contrario KCC2, andando avanti con lo sviluppo, si trovava maggiormente localizzata nei processi neuronali. Risultati recenti dimostrano che l’H2O2 è un donatore endogeno di specie reattive dell’ossigeno, presente nel CNS in concentrazioni μM (Lei et al., 1998). Nel midollo spinale post-natale l’H2O2 è stata recentemente indicata anche come un mediatore solubile dipendente dal Ca2+ intracellulare, capace di modulare la plasticità sinaptica in condizioni sia fisiologiche che patologiche (Takahashi et al., 2007). In questo mio studio, concentrazioni fisiologiche di H2O2 aumentavano il livello basale del Ca2+ intracellulare solo nei neuroni che oscillavano, senza però cambiare il periodo delle oscillazioni. Il fatto che i neuroni oscillanti fossero le sole cellule che rispondevano a basse dosi di H2O2 ci ha suggerito che questi interneuroni spinali potrebbero essere dei critici trasduttori dell’azione modulatoria dell’H2O2. In questo modo, un piccolo gruppo di interneuroni ventrali (a 2 settimane di crescita in vitro) potrebbe essere caratterizzato da due marcatori funzionali: la sensibilità all’ H2O2 e la capacità di produrre oscillazioni spontanee. Sembra molto interessante supporre che le periodiche oscillazioni al Ca2+ e la sensibilità all’H2O2 conferiscano a queste cellule la capacità di modellare la plasticità dei circuiti locali attraverso differenti cambiamenti (fasici o tonici) nella concentrazione del Ca2+ intracellulare.

In the last decade there has been new interest in the posterior nucleus of the hypothalamus (PIH) as the target for the placement of deep brain stimulation to improve pain and psychiatric symptoms. This has brought the possibility to study single-unit acitvity from PIH. Very scanty information is available regarding the firing discharge of human’s PIH neurons. The aim of this study is to describe the firing discharge properties of PIH neurons in neurological and psychiatric disorders. Continuous physiological extracellular recordings were obtained in awake and sedated humans. Firing rate analysis, time domain and frequency domain analyses were used to characterize the firing pattern of PIH neurons. 19 PIH neurons from 7 patients were further studied (5 patients with Trigeminal Autonomic Cephalalgias, 1 aggressive behavior associated with epilepsy, and 1 aggressive behavior associated with head injury). During wakefulness PIH neurons displays tonic firing discharge at around 25Hz, while during sedation the firing rate is 12Hz and the firing pattern more variable. In aggressive behaviour and epilepsy the firing discharge is phasic and rhythmic with oscillations locked at around 7-8Hz. Regular and irregular tonic discharge is noticed in aggressive behaviour and head injury. Spontaneous activity in awake TACs patients is similar to what has been reported in animal models. Interestingly, in aggressive behaviour with epilepsy the observed pattern is bursting and rhythmic at around 7-8Hz. In the patient with head injury no specific pattern is found in PIH neurons. At this stage of knowledge these data are a novelty in the literature, thus it is not possibile to exclude that all these observations represent normal features of PIH neurons. However the differences noticed between pathologies may suggest that PIH neurons discharge rates and patterns are associated to the underlying neurological and psychiatric condition.

Regenerative medicine is a broad interdisciplinary field, tremendously grown in the last decades, which encompasses several different research areas, such as biomaterial sciences and tissue engineering, whose unifying concept holds an enormous therapeutic potential, being that of restoring impaired organs or tissue functions, resulting from congenital defects, trauma or disease (Greenwood et al.; 2006; Mason and Dunnill, 2008). The main challenge faced by tissue engineering is the need to have a renewable source of cells and biomaterials possessing the right mechanical, chemical and biological features, to create constructs resembling native tissues. The design of scaffolds able to support and promote tissue regeneration and/or functional restore, in particular, is a critical step for the success of an implant, as it should recapitulate the complex architecture of the physiological microenvironment, e.g. the appropriate extracellular matrix, which has been shown to actively direct the behaviour of cells, through both chemical and physical cues (Daley et al., 2008; Place et al., 2009; Rozario and DeSimone, 2010). In this context, nanotechnology tools may greatly enhance the success of tissue engineering strategies, by providing the chance of producing surfaces and materials with topographical features that mimic the natural ones, in addition to the possibility to functionalize nanomaterials with bioactive molecules (Gelain et al., 2008; Zhang and Webster , 2009; Dvir et al., 2011; Koh et al., 2008). Among nanomaterials, carbon nanotubes (CNTs) stood out, since their discovery, for their outstanding mechanical, electrical and thermal properties, like their extraordinary strength coupled with remarkable flexibility, or their high electrical conductivity, which make them a well-suited platform technology for biomedical applications. Recently, several works have been published, which support the use of CNT-based scaffolds to promote neuronal attachment, differentiation and growth (Mattson et al., 2000; Hu et al., 2004; Hu et al., 2005; Galvan-Garcia et al., 2007). Moreover, in the last decade, our group showed that CNT/neuronal hybrid networks show a boost in synaptic transmission (Lovat et al., 2005; Mazzatenta et al., 2007) and that the direct contact established between single CNT and neuronal membranes affect single neuron integrative abilities (Cellot et al., 2009), besides promoting network connectivity and synaptic plasticity phenomena in cortical cultured circuits (Cellot et al., 2011). Here, to extend our knowledge about interactions between CNT and neurons, we long-term cultured organotypic spinal explants, possessing a complex multilayered cytoarchitecture, with highly purified MWCNT scaffolds and then investigated, via a multidisciplinary approach, their growth and synaptic activity. Our aim was to verify whether and how a CNT-induced effect on neuronal performance could be transferred to network locations, which are far from the neuronal/MWCNT layer of interaction, but sinaptically communicating with it. We documented, via TEM investigations, the presence of tight connections established between the neuronal membranes of neurons belonging to the bottom layer of the spinal tissue and the CNT meshwork underlying it. By means of confocal microscopy, SEM and AFM techniques, we showed, for the first time, that the long-term interfacing of spinal cord explants to CNTs induced an increase in the number and length of peripheral neuronal fibres outgrowing the spinal tissue, associated to changes in growth cone activity and in fibre elastomechanical features. We also demonstrated, via patch-clamp recordings performed from interneurons in the ventral (premotor) area of the explants, that both spontaneous and evoked synaptic currents displayed a potentiation in the presence of the CNT scaffold, detected as an increase in current amplitude in neurons which were as far as 5 cell layers from the tissue/substrate site of interaction. We speculate that these two effects (the increased fibres growth and the boosting in synaptic activity) rely upon two different mechanisms, a direct and a remote one, by which CNTs affect the spinal tissue development. Indeed, the first exerted on fibres directly adhering to the CNT substrate, while the second is likely to be mediated by alterations occurring at the tissue layer integrated with CNTs, which are transmitted, through a remote effect, to distant network locations, synaptically communicating with such a layer. These results support the hypothesis that CNTs may be employed to boost spinal neurite re-growth and functional spinal performance, in the perspective of re-establishing the physical and functional communication between disconnected spinal segments, We therefore decided to implement a model in which two organotypic spinal explants grow together on the same support, as a useful model for neuronal reconnection investigations and to test the possibility that a CNT-based scaffold, interposed between the two explants, may act as a bridge to promote the physical and electrical communication between the two spinal segments. By means of immunostaining experiments and confocal microscopy we reported the presence of a huge amount of fibres, projecting from the two spinal slices and integrating in a complex network, especially localized in the DRG regions, while very few fibres seemed to directly connect the two explanted tissues at the level of the explants cores. When, via voltage-clamp pair recordings, we looked for the presence of an electrical reconnection between explants, we found a small percentage of co-cultured explants displaying a complex coupled behaviour, detected as a strongly correlated bursting activity. These preliminary data seem to confirm the goodness of such an in vitro model to investigate the intrinsic reparative potential of spinal cord tissue and to improve such ability via nanotechnological tools.

Università degli studi di Trieste Riassunto Ruolo dei canali di K+ hERG nello sviluppo neuronale e nella fisiopatologia dell’epilessia Ciclo: XX Coordinatore: Chia.ma Prof.ssa Paola Lorenzon Dottorando: Emanuele Cilia Lo scopo di questa tesi è stato quello di individuare e definire una correlazione fra canali della famiglia ERG e la sindrome epilettica. Le motivazioni che hanno spinto ad affrontare sperimentalmente questo argomento risiedono, da una parte nel crescente coinvolgimento dei canali voltaggio-dipendenti nell’epilessia, dall’altra dal fatto che i canali ERG sono altamente espressi nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) di topo e di ratto e sono in grado di controllare l’eccitabilità neuronale. Studi di espressione relativi ai geni e alle proteine di questa famiglia sono stati condotti, nel nostro laboratorio, sul SNC di topo (Guasti et al., 2005). Una prima parte del lavoro oggetto della presente tesi ha avuto pertanto lo scopo di approfondire tali studi di espressione, applicandoli anche a colture organotipiche di midollo spinale, ottenute da topi sia in età embrionale che neonatale. Tali studi, nei quali è stata verificata l’espressione dei canali ERG sia a livello di m-RNA che di proteina hanno evidenziato che tutti i geni (e le proteine) m-erg sono espressi in tali colture, seguendo un preciso pattern spazio-temporale (Furlan et al., 2005). Tali studi hanno inoltre permesso di ipotizzare un ruolo importante della corrente ERG IK(ERG) durante le prime fasi dello sviluppo, essendo espresso in maniera specifica ed età-dipendente solo da alcune specifiche popolazioni neuronali. In seguito, una volta completato lo studio del pattern di espressione dei geni e delle proteine ERG nel SNC di topo e di ratto, è stata avanzata l’ipotesi che i canali ERG potessero essere coinvolti nel fenomeno epilettico. Pertanto, la seconda parte del lavoro oggetto della presente tesi si è basato sulla analisi della modulazione dei geni erg nell’ippocampo di topo durante l’induzione di epilessia sperimentale ottenuta tramite l’inoculo di acido Kainico e Pilocarpina. Il lavoro sperimentale si è articolato in due fasi: nella prima fase è stato asportato l’ippocampo di topi inoculati con farmaci epilettogeni (acido Kainico e Pilocarpina) e di topi inoculati con soluzione fisiologica (considerati topi di controllo); nella seconda fase gli ippocampi sono stati tagliati (ad una determinata distanza dal punto Bregma) e sono state asportate tre fette, su cui sono stati eseguiti esperimenti di Real Time PCR al fine di quantificare l’espressione dei geni m-erg1, m-erg2 e m-erg3. Nessuno dei tre geni m-erg è stato modulato in modo significativo a seguito delle crisi epilettiche indotte né da acido Kainico, né da Pilocarpina. Questi risultati apparentemente negativi ci hanno viceversa stimolato a valutare l’ipotesi opposta, e cioè se alterazioni primitive della funzionalità dei canali ERG potessero essere in grado di rappresentare il “primum movens” della malattia epilettica. Nella terza parte della presente tesi, è stata pertanto condotta un’analisi genetica in famiglie affette da epilessia idiopatica valutando eventuali mutazioni del gene herg3, (KCNH7), al fine di valutare un ruolo patogenetico di tale canale in questo tipo di sindrome. La nostra attenzione si è rivolta verso lo studio di questo gene, perché risulta l’unico, della famiglia ERG, ad essere espresso specificamente nel SNC senza alcuna espressione a livello cardiaco, come accade per herg1. A tale scopo è stato messo a punto un protocollo sperimentale per l’analisi del DNA genomico mediante la tecnica della DHPLC (Denaturyng High Performance Liquid Chromatography) e successivo sequenziamento. Sono stati identificati 3 profili mutati, nelle sequenze relative agli esoni 4 (dominio N-terminale della proteina), 6 (regione comprendente la prima porzione transmembrana) e 13 (porzione C-terminale). Sono state inoltre identificate le specifiche mutazioni nucleotidiche che provocano un cambiamento nella sequenza amminoacidica. In particolare a livello dell’esone 13 è risultata un cambiamento nucleotidico a→g, che determina, a livello amminoacidico, un cambio Serina (AA basico)→Glicina (AA neutro). Nell’esone 4 la mutazione c→a determina, a livello proteico, una sostituzione dell’amminoacido basico Istidina (H) con Asparagina (N), molecola neutra. Il profilo dell’esone 6 evidenzia la sostituzione di base a→g in una porzione intronica tra l’esone 6 e 7, questo sito risulta di minor interesse rispetto agli altri perché non viene espresso. E’ stato infine analizzato l’effetto delle mutazioni trovate a livello dell’esone 4 e dell’esone 13 sulle proprietà elettrofisiologiche e sulla localizzazione cellulare. Questi esperimenti sono stati condotti presso il laboratorio del Prof. E. Wanke (Università di Milano Bicocca). Dall’analisi delle proprietà biofisiche della corrente mediata dai canali codificati dai plasmidi mutagenizzati, è emerso che tutte le correnti mediate dai mutanti presentano uno slittamento della curva di attivazione verso valori più iperpolarizzati. In cellule neuronali, dove queste proteine sono in grado di regolare la frequenza di scarica, ciò potrebbe influenzare le proprietà biofisiche alla base dell’eccitabilità cellulare.

Le nanotecnologie sono un campo delle scienze che utilizza materiali e dispositivi ingegnerizzati aventi la più piccola organizzazione funzionale a livello di dimensioni nanometriche. Questo implica che nanodispositivi e nanomateriali possano interagire con i sistemi biologici a livello molecolare con un elevato grado di specificità. É largamente accettato che l’applicazione delle nanotecnologie nell’ambito delle neuroscienze abbia un forte potenziale (Silva, 2006). In questo contesto, i nanotubi di carbonio (CNT), un’innovativa forma di carbonio composta da strutture tubulari di grafite dalle dimensioni nanometriche dotate di buone proprietà di conduzione elettrica, si sono dimostrati promettenti candidati per sviluppare la tecnologia di dispositivi impiantabili in ambito biomedico. Diversi studi hanno dimostrato la biocompatibilità dei substrati di CNT per i neuroni in termini di adesione, crescita e differenziamento cellulare (riassunti in Sucapane et al., 2009). Al fine di aumentare la nostra conoscenza riguardo alle interazioni presenti in sistemi ibridi formati da CNT e neuroni, abbiamo caratterizzato l’attività di reti neuronali cresciuti su supporti di CNT attraverso la tecnica del patch clamp. Il nostro gruppo ha riportato che circuti neuronali cresciuti in vitro su substrati di CNT presentano un’aumentata attività sinaptica spontanea rispetto al controllo a fronte di comparabili proprietà base (proprietà passive di membrana, morfologia e densità dei neuroni) delle colture nelle due condizioni di crescita (Lovat et al., 2005). Si è quindi ipotizzato che tale aumentata attività spontanea potesse originare da una modificazione nel modo in cui i singoli neuroni generano il segnale elettrico. A tal fine, si sono monitorate variazioni nelle proprietà elettrogeniche di singoli neuroni, utilizzando un protocollo standard per caratterizzare l’integrazione di potenziali d’azione retropropaganti nei dendriti (Larkum et al., 1999). In configurazione current clamp, attraverso brevi iniezioni di corrente nel soma della cellula, abbiamo indotto una serie di regolari potenziali d’azione (PA) a varie frequenze nel neurone sotto registrazione, quindi abbiamo studiato la presenza di un’addizionale depolarizzazione somatica dopo l’ultimo PA del treno. Abbiamo osservato che neuroni di controllo mostrano nella maggioranza dei casi una iperpolarizzazione (AHP) del potenziale di membrana dopo l’ultimo PA del treno, mentre una depolarizzazione (ADP) è presente solo in una piccola quota di casi. In presenza di CNT, invece, l’ADP risulta essere l’evento predominante. L’ADP è inoltre abolita dall’applicazione di CoCl2, un bloccante non specifico dei canali calcio voltaggio dipendenti. Per di più, l’area dell’ADP può essere diminuita dall’applicazione di nifedipina (10 μM) e l’ulteriore coapplicazione di NiCl2 (50 μM) elimina totalmente l’ADP, suggerendo che sia i canali calcio voltaggio dipendenti ad alta soglia di attivazione, sia quelli a bassa soglia, siano coinvolti in questo processo (Cellot et al., 2009). Attraverso la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e, più recentemente, mediante quella a scansione (SEM) è stata messa in evidenza la presenza di discontinui punti di stretto contatto tra CNT e membrane neuronali: la nostra ipotesi è che tali strutture ibride siano in grado di favorire la retropropagazione dei PA nei dendriti distali. La maggiore eccitabilità a livello del singolo neurone, inoltre, potrebbe essere responsabile dell’incremento di attività spontanea della rete neuronale. Abbiamo quindi ulteriormente caratterizzato l’attività della rete neuronale attraverso registrazioni da coppie di neuroni, dove il neurone presinaptico veniva stimolato ad avere treni di potenziali d’azione a 20 Hz in configurazione current clamp e simultaneamente il neurone postsinaptico era monitorato in configurazione voltage clamp per vedere la presenza o l’assenza di una risposta sinaptica. I nostri esperimenti indicano che la probabilità di trovare connessioni monosinaptiche gabaergiche tra neuroni è aumentata in presenza di CNT (56% vs 40% in controllo). Inoltre, è stato rilevato un ulteriore effetto dei CNT sulla plasticità a breve termine delle sinapsi: nelle condizioni di controllo, treni di potenziali d’azione nella cellula presinaptica evocano nella cellula postsinaptica nel 90% dei casi una chiara depressione nell’ampiezza di consecutivi ePSCs, mentre solo in meno del 10% è possibile rilevare una facilitazione. Al contrario, in presenza di CNT, nel 39% delle coppie, il neurone postsinaptico risponde in modo chiaramente facilitativo. Nelle più recenti serie di esperimenti, abbiamo voluto indagare più approfonditamente l’origine di questa modificazione in termini di plasticità sinaptica; a tal fine, abbiamo trattato neuroni in controllo e su CNT con tetrodotossina 1 µM per 5 giorni, al fine di bloccare completamente l’attività elettrica della rete neuronale, e abbiamo compiuto delle registrazioni da coppie di neuroni. Mentre la risposta prevalentemente di depressione dei controlli non è modificata da tale trattamento, neuroni cresciuti su substrati di cnt in condizioni di blocco dell’attività elettrica non presentano più sinapsi con caratteristiche di facilitazione, ma hanno un comportamento simile ai contolli. Questi risultati indicano che la facilitazione è una proprietà tipica di sinapsi attive sviluppatesi in presenza di CNT.