Scienze biologiche

Il peptide 2A è un peptide virale di 18-23 aminoacidi presente in alcuni picornavirus, dei virus a RNA che codificano per una poliproteina che viene poi processata per produrre tutte le proteine virali. Il peptide 2A, in particolare, permette la divisione tra le proteine capsidiche e quelle replicative. Durante la traduzione il peptide 2A agisce come elemento autonomo, in grado di mediare il suo processamento al C-terminale: per farlo modifica l'attività del ribosoma, promuovendo l'idrolisi del legame estere tra il peptide nascente e il tRNA anziché che la formazione del legame peptidico, con il conseguente rilascio prematuro della proteina a monte e la continuazione della traduzione dalla Pro a valle. Abbiamo chiamato questa proprietà "terminazione non convenzionale della traduzione", per distinguerla dalla terminazione convenzionale che si verifica in presenza di un codone di STOP e che viene mediata dai fattori di rilascio 1 e 3. Per questa sua attività, sia degli aminoacidi Asn-Pro-Gly al C-terminale del peptide 2A che la Pro al N-terminale della proteina a valle sono essenziali. Grazie alla sua capacità di autoprocessamento, il peptide 2A può essere utilizzato per produrre due proteine da un unico open reading frame (ORF) . Nella prima parte del lavoro abbiamo testato due differenti peptidi 2A (uno derivante dal Foot-and-Mouth Disease Virus (F2A), e uno dal Porcine Teschovirus (T2A) per trovare eventuali differenze tra la loro attività in termini di terminazione non convenzionale e di reinizio della traduzione dalla Pro a valle. Entrambi questi peptidi si sono mostrati molto efficienti nella terminazione non convenzionale, come si nota dalla quasi totale assenza di proteina di fusione. Tuttavia, il reinizio della traduzione dalla Pro valle 2A non è completo, come si evince dal fatto che la proteina a valle viene prodotta in una quantità inferiore rispetto a quella a monte. Abbiamo determinato che F2A funziona meglio T2A, in quanto consentee la sintesi della proteina a valle con maggiore efficienza. Questi risultati indicano che il peptide F2A è un ottimo sistema per la co-espressione di proteine in vivo. Abbiamo sfruttato questa tecnologia per la produzione di anticorpi ricombinante, riuscendo a produrre sia in vitro che in vivo la catena leggera e pesante dell’anticorpo, che inoltre si assembla correttamente. Nella seconda parte del lavoro abbiamo studiato una caratteristica particolare del peptide 2A: quando viene posizionato immediatamente a monte di un codone di stop, l'espressione della proteina a monte è fortemente compromessa. Questa caratteristica è dovuta alla sequenza amminoacidica, e non a quella nucleotidica. La causa di questa compromissione dell’espressione risiede in un forte stalling del ribosoma al sito Gly-STOP, totalmente dipendente dagli ultimi tredici residui del peptide 2A e dalla presenza degli amminoacidi C-terminali Asn-Pro-Gly terminali. Come conseguenza del blocco, viene attivato un controllo di qualità a livello del ribosoma, che induce l’ubiquitinazione e la degradazione da parte del proteasoma della piccola quantità di proteina prodotta. Questa attività di controllo da parte del peptide 2A sulla traduzione è efficace sia su ribosomi legati alla membrana dell’ER, che su quelli liberi nel citosol. Per i ribosomi legati alla membrana, abbiamo identificato il coinvolgimento di alcuni membri del pathway di retrotraslocazione come l’AAA ATPasi p97 e la deubiquitinase YOD1, suggerendo un meccanismo di controllo di qualità che rileva la presenza di ribosomi in stallo sul lato citosolico della membrana dell’ER e la segnala ad effettori presenti nel lato luminale per indurre la degradazione associata all’ER (ERAD) dei peptidi nascenti. E’ noto che uno dei principali mediatori dell’ERAD è l'AAA ATPasi p97/VCP; si che p97 sia necessaria per la retrotraslocazione e la degradazione da parte del proteasoma dei substrati ERAD, e che la sua perdita provoca la loro ritenzione nel lume dell’ER. Di conseguenza, l’attività ATPasica di p97 è ritenuta essenziale per l'estrazione delle proteine dalla membrana dell’ER . Per studiare il ruolo di p97 in ERAD, abbiamo usato un metodo recentemente sviluppato nel nostro laboratorio (Petris et al., 2011) che consiste nella mono-biotinilazione in vivo, da parte della biotin ligasi citosolica Bira, di substrati proteici taggati con il Biotin Acceptor Peptide BAP (GLNDIFEAQKIEWH). Questo metodo consente una discriminazione precisa tra le proteine che si trovano nel lume dell’ER (non biotinilate) e nel citoplasma (biotinilate). Abbiamo analizzato l'effetto di: 1) una forma dominante negativa di p97 (p97QQ), 2) un siRNA specifico per p97, e 3) l’inibitore chimico di p97 DBeQ, in tre diversi substrati modello di ERAD: NS1, il mutante Null Hong Kong dell’α1-antitripsina (NHK-α1AT), e Tetherin. I nostri risultati sono in contrasto con la visione predominante di p97 come fornitore di energia per l'estrazione delle proteine dall’ER in maniera ATP-dipendente. Abbiamo trovato che l'attività di p97 non è coinvolta nella retrotraslocazione di queste proteine, ma piuttosto nella separazione delle proteine, già nel lato citosolico, e nel reclutamento della PNGase. Risultati simili sono stati ottenuti analizzando l'effetto di una forma dominante negativa della deubiquitinase p97-associata YOD1 (YOD1 C160S).