PREGRESSO

In questo lavoro si è cercato di fornire gli strumenti per l'analisi del proteoma della membrana plasmatica con particolare interesse nei confronti delle glicoproteine e delle eventuali modificazioni della loro componente oligosaccaridica, nell'ambito deii'HCC, con lo scopo di individuare nuovi marker glicoproteici da utilizzare in diagnostica e terapia. La componente oligosaccaridica delle glicoproteine di membrana viene coinvolta e continuamente rimaneggiata in diversi processi biologici, che vanno dalla regolazione del sistema immunitario alla comunicazione cellulare, dallo sviluppo embrionale alla capacità patogenetica degli agenti infettivi, dal ripiegamento della catena lineare dei polipeptidi fino allo sviluppo dei tumori e di altre importanti patologie[1J. La limitata disponibilità di dati sperimentali di riferimento per quanto riguarda un approccio di proteomica della membrana plasmatica, ha reso ardua l'interpretazione di molti dei risultati ottenuti riportati in questo lavoro di Tesi. In via preliminare si è reso necessario mettere a punto la maggior parte dei protocolli sperimentali atti ad ottenere il maggior grado di informazioni possibile in merito all'espressione differenziale delle glicoproteine di membrana. Questa fase propedeutica ma indispensabile ha impegnato gran parte del tempo richiesto per lo sviluppo di questo progetto di ricerca. L'approccio sperimentale ha previsto l'utilizzo di due modelli di linea epatocitaria. La linea CHANG, derivante da tessuto di fegato normale, mostra una notevole somiglianza con le cellule normali di fegato ed è citata spesso in letteratura come modello di epatocita in condizione fisiologica[2J. Le cellule HepG2 sono una linea cellulare stabilizzata in coltura derivata da cellule di un epatocarcinoma umano. In primo luogo è stato necessario mettere a punto un metodo di estrazione, confrontando e modificando alcune delle metodofogie già esistenti, al fine di sviluppare una strategia che permettesse di ottenere i risultati migliori in termini di purezza e arricchimento del campione proteico4 Più precisamente, tra queUe disponibili, due sono state messe a confronto e svituppate a seconda detre nostre esigenze . Analizzando i campioni di proteine estratte secondo la strategia differenziate proposta da MoUoyf31 dopo separazione etettroforeticai si è osservato un potenziale arricchimento in proteine dl membrana,. ma la contaminazione da parte della componente dtopfasmatica o proveniente dalle membrane degli organe Ui è. risultata essere ancora troppo a.fta .. Al metodo appena lndicato si è prefertto· queflo che prevede fa marcatura con un derivato della biotina e Ja successiva purificazione su colonna funzionalizzata con avidina[4l: si .è dimostrato, infatti, che attraverso questo metodo estrattivo si possono ottenere proteine che presentano un peso molecolare elevato e che per la maggior parte appartengono alla classe deHe glicoproteine, essendoci una buona corrispondenza tra n profiJo proteico rivelato in colorazione argentica e quello rivelato con un metodo di colorazione specifico per le glicoproteine (ProQ Emerald 300). Inoltre, tramite analisi di immunocitochimica, in fase pre-estrattiva, e di western blot si è verificato che tutte le proteine estratte sono biotinilate; infine, dai gel bidimensionali ottenuti sono evidenziabili le caratteristiche tipiche delle glicoproteine, che si presentano come trenini di spot costituiti delle diverse glicoforme esistenti, differenti tra loro sia per pi che per massa relativa. l'osservazione di questi risultati ci ha fatto ragionevolmente supporre che il metodo di estrazione e purificazione prescelto portasse, effettivamente, ad un arricchimento in proteine di membrana. Successivamente l'analisi comparativa eseguita sulle mappe prote;che relative alta linea· cellulare· CHANG ed HepG2 ha messo in luce numerose differenze, dì tipo proteìco, esistenti a livello della membrana cellulare, ma ha evidenziato anche aJcune somigJianze degne di nota. s; è sceJto dì cominciare l'identificazione delle proteine da quelle che risultavano comuni ad entrambe le linee cellulari e che, ad una prima osservazione dei gel, si presentavano come treni di spot associabili a diverse glicoforme di una glicoproteina. Le analisi di spettrometria di massa hanno fornito risultati interessanti·; anche se inaspettati.. Di particolare importanza è il ritrovamento di segnali attribuibili a proteine con funzioni di Chaperoninei4J .. Tra queste sono state identificate, costantemente:: GR.P78/Bip, HSP60, MTHSP75, HSP90, gp96/GRP94 per entrambe le linee cellulari., mentre POI è stata identificata nelle HepG2. Ed è stata proprio " l' inusualità " di .questo dato che ci ha stimolato a proseguire su una nuova linea interpretativa e a verificare fa possibilità che effettivamente queste proteine fossero presenti su una membrana plasmatica dei modelli cellulari studiati1 da un lato per vatidare le metodologie sviluppate, dall'altro per sfruttare il potenziale informativo fornito da un dato che, seppure anomalo, rimane comunque estremamente interessante. La particolarità di questo risultato risiede nella "anomala" localizzazione topografica di questa dasse di proteine che, normalmente, hanno una tipica.. ma non esclusiva.. localizzazione citoplasmatica o collocazione a livello di reticolo endoplasmatico. Per molte di queste chaperonine si è cercato di dare un interpretazione all'inconsueta localizzazione. In questo lavoro sono state analizzate in maniera più dettagllatate proteine che, tra quelle identificate, presentavano aspetti interessanti sia da.t punto di v.ista funzionale (HSP90 e GRP78) che glicobiologico (gp96). Caratteristica di· tutte- le- proteine- con localizzazione· a llveflo· def- RE, come- GRP94 e GRP78, è la presenza, nella porzione C-terminale, di una particolare sequenza amminoacidica KDEL {lys-Asp-Giu-Leu) che ne garantirebbe la· permanenza a- livello- del· REr51.. Nonostante questa peculiarità, esistono diversi riscontri sperimentali che dimostrano la localizzazione dì GRP78 e gp96 anche a livello della membrana plasmatìca dove sì. assocerebbero con altre proteine in alcuni casi non ancora identificate, per formare complessi di diverse dimensioni.. I meccanismi molecolari chiamati in causa per spiegare la "fuga" di proteine KDEL dal RE alla superficie della membrana plasmatica sono diversi. Ad esempio alcuni dati sembrerebbero attribuire questo evento ad una saturazione dei recettori per KDEL con conseguente perdita di alcune proteine che sarebbero in grado di migrare verso la membrana plasmatica. In altri casi il difetto nel sistema di ritenzione potrebbe essere dovuto alla presenza di .forme tronche delle proteine o difettive del dominio di riconoscimento. Un'altra ipotesi prevede che l'associazione delle proteine KDEL con proteine che sono destinate ad essere esportate verso la membrana plasmatica possa bloccare stericamente H dominio KDEL, impedendone l'interazione con il· rispettivo recettore e comportando la comigrazione verso la membrana plasmatica. Queste ossetvazioni, per quanto interessanti, rappresentano comunque solo interpretazioni finalistiche di un comportamento- che, alla fuce dei risultati riportati in questo favoro e di· quelli in letteratura, potrebbe essere molto più importante e di maggior significato biologico: non è un caso che tutti i dati più significativi e, al momento,. più. c.ompJeti. riguardano forme ceJJuJari associate a. trasformazioni neoplastiche .. Su HSP90, in letteratura, sono state fatte le considerazioni più interessanti. Dati recenti attestano la sua localizzazione sulla superficie cellulare in particolare sulla -membrana -dei -neuroni nelle fasi .precoci delt.o sviluppo de.l sistema nervoso: si ipotizza che questa chaperonina sia coinvolta nella migrazione cellulare[6J. Inoltre, è stato proposto che, sulla superficie cellulare, .HSP90 svolgesse un .ruolo attivo, in questo caso ln senso migratorio, partecipando a qualche meccanismo che· porta la cellula a· staccarsi dalla matrice extracellulare e dalle cellule vicine. Questo dipenderebbe dalla stretta relazione che esiste tra HSP90 e MMP2, enzima. coinvolto nel rimodellamento-della-matrice extracellulare[7l. Dal punto dì vista dì un approccio glicomico alla trasformazione neoplastìca e facendo salvo il concetto ormai accettato e dimostrato della stretta associazione tra. Ja trasformazione neo.pJastica e la: modificazione dei. pattem di glicosilazione appare piuttosto interessante l'osservazione secondo la quale alcune di queste proteine vengano attivate ad alti livelli in presenza di inibitori della glicosilazione. Le alterazioni della glicosilazione potrebbero essere, entro certi limiti, assimilate agli effetti prodotti dal trattamento con inibitori della glicosilazione. Non bisogna dimenticare, inoltre, che questi chaperone molecolari sono deputati al controllo e alla successiva eliminazione di proteine non correttamente ripiegate e/o glicosilate: una loro alterata funzionalità potrebbe risolversi in una mancata eliminazione o sequestramento detta proteina non funzionale con conseguente trasporto della stessa al compartimento di competenza. La presenza, quindi, di proteine non correttamente gticosilate sulla membrana plasmatica potrebbe essere· dovuta a meccanismi di· eliminazione alterati a livello del RE- e del· Golgi. Certamente questa è semplice considerazione ipotetica che, in ogni caso, potrebbe costituire una buona base di partenza per ulteriori e più a-pprofonditi. studi. In questo lavoro si è cercato non solo di ottenere gli strumenti per facilitare la comprensione del proteoma di membrana ma anche. porre. te basi per lo studio e ·la caratterizzazione degli N-glicani associati a questo compartimento. Quest'ultimo aspetto sperimentale è piuttosto rilevante: la possibilità di sviluppare una gUcoproteomica in senso stretto- si è sempre scontrata con .ta sostanziale incompatibilità dei metodi disponibili in letteratura, che comportavano o la perdita della componente saccaridica o n· sacrificio di quella proteicarsJ. Fintanto che l'approccio glicoproteomico era rivolto esclusivamente all'identi.ficazione de.l complessQ delle proteine espresse da una cellula; ciò· non· ha mai costituito un problema; quando· invece si rende necessaria un'analisi di un compartimento esclusivo come quello della membrana plasmatica, dove la componente glicoproteica è poco rappresentata, il discorso è diverso. In taf senso, f'ottimìzzazìone degfi approcci sperimentali di 2-DE che consentono la simultanea caratterizzazione della porzione oligosaccaridica e di quella proteica è auspicabile se non indispensabile... Proprio in quest'ottica risiede l'importanza dei risultati ottenuti in questo ·lavoro, ossia nell'aver messo a punto un efficiente metodo di degli cosilazione in gelr9J in associazione alla separazione 20-E, che permettesse di mantenere integra ed analizzabile sia la componente oligosaccaridica che quella proteica, per lo sviluppo di una completa glicomica della membrana plasmatica.

lf carbohydrates are viewed not merely as energy suppliers for sustaining life but their intriguing biological role, chiefly as modulators of cell communication, is investigated, then we approach the field of glycobiology. This nontrivial task of glycans arises from their inherent structural complexity (great variety of linkage and branching occurrence) an d their ubiquitous location in the cell and extracellular matrix. Most glycans densely cover the outer cellular surface and are exposed to an environment of many proteins (such as growth factors, cytokines, toxins, enzymes and others). This particular position enables them to mediate several cell-cell or cell-matrix interactions and act as recognition determinants in a great variety of important cellular events ( adhesion, proliferation and differentiation). Therefore, the comprehension of the unique function of carbohydrates in biology calls for a structural characterization of saccharides, considered either as sugar chains or as integral part of glycoconjugates, and their interaction partners, such as carbohydratebinding proteins. The aim of the present work was essentially methodological in kind, i.e. directed towards the development of techniques and experimental procedures for the analysis (identification/detection, characterization, synthesis) of given carbohydrate sequences, frequently occurring in nature, glycoproteins and sugar-binding proteins. l. Derivatization of saccharides for UV -visible detection on capillary electrophoresis CE). Concerning the compositional monosaccharide determination of a hydrolyzed glycan pool, which is frequently the first step in oligosaccharide mapping, we developed and optimized experimental methods aimed to improve the UV -vis detection of monoand oligosaccharides present as widespread components in mammalian and plant glycoproteins. Saccharides inherently lack chromophores and must be suitably derivatized, i.e. covalently linked to a chromophore usualiy through reductive amination, prior to detection on CE. Derivatization yield, however, depends on the nature of the sugar residue and N-acetylamino sugars, such as N-acetylgalactosamine (GalNAc) and N-acetylglucosamine (GlcNAc), occupying the reducing end of respectively 0- and N-glycan sequences, are notoriously difficult to label. A comparative study aimed at the improvement of a labelling procedure, enhancing the detectability of N -acetylamino sugars, was therefore performed. The results showed that, among frequently used tagging dyes, 2-aminobenzoic acid turned out to be the most efficient, offering high and comparable sensitivity at the CE UV -vis detector for ali saccharides tested. Choosing adequate CE running conditions, a mixture of eleven monosaccharides was efficiently separated in a very short time frame. 2. Immobilized beta-galactosidase-based synthesis ofN-acetyllactosamine (LacNAc) The abovementioned findings of suitable derivatization procedure for the UV -vis detection of reducing sugars was successfully applied to the detection of LacNAc from crude reaction mixtures via CE. This disaccharide is very commonly located at the outermost portion of complex celi surface oligosaccharides of glycoconjugates and is therefore directly involved in recognition processes between cells. The enzymatic synthesis in heterogeneous phase of the LacNAc disaccharide was here attempted. The goal of the study was to improve both product yield and recovery of the biocatalyst through its immobilization on solid supports (commercial polymers Eupergit® and Sepabeads ), in comparison with the synthesis performed with the free enzyme in solution. The biosynthesis was performed through transglycosylation reaction with beta-galactosidase from B. circulans starting from p-nitrophenyl galactopyranoside as the glycosyl donor and GlcNAc as the acceptor. The reaction was followed monitoring via CE the disaccharide production in function of time. The kinetic analysis revealed that the immobilization procedure did not suppress catalytic activity, but, on the contrary, improved the galactose transfer efficiency of the enzyme. Kinetic profiles of the reactions performed with Eupergit® or Sepabeads were qui te different, suggesting that the physico-chemical properties of the supporting matrices infuence enzyme behaviour. Maximum LacNAc molar yield (64%) was obtained using Eupergit® as solid carrier. 3. Glycan structure analysis The identification and quantitative analysis of oligosaccharide portions of glycoproteins of biotechnological, like beta-glucosidase, or therapeutical interest, such as membrane proteins of hepatic celllines, was here carried out according to two alternative glycoprotein processing strategies. (3a) Prior to commercialization, recombinant beta-glucosidase (GCase) produced in transgenic tobacco seeds must be first thoroughly characterized in order to test whether the glycosylation pattem of the glycoprotein expressed in plant resembles that of the human placenta} GCase. Treatment with trifluoroacetic acid led to exhaustive hydrolysis of the glycan moiety and o n the released monosaccharides a CE analysis was carried out. Since neither fucose nor xilose, frequent sugar residues found in plant glycoproteins, could be detected, potential immunogenicity for delivery to humans was excluded. (3b) The scientific relevance of studying the glycan structure of membrane-bound proteins, differently expressed in a healthy and hepatoma cell line, relies on the possible detection of early-stage saccharidic tumoral markers. In order to develop and optimize a methodological procedure, based on the in-solution or in-gel enzymatic release (with PNGase F) of entire oligosaccharide chains and analysis through LC/MS of the hydrolizate, that could be exported to the glycosylation pattem analysis of membrane proteins, the commerciai bovine fetuin was here used as a model of a heavily glycosylated protein. From the obtained data, a biantennary and two triantennary oligosaccharide structures, pertaining to the N-glycosylation profile of Fet, could be finally assigned. 5. Large-scale biosynthesis of a Hpylori lysozyme Much effort has been devoted to the study of a Hpylori lysozyme (Lys), an enzyme that seems to play a key role in the autolysis of the bacterium during colonization of the gastric epithelium of primates. In order to attempt structural characterization of the protein, either alone or in complexed form with its saccharidic substrate (Nacetylmuramic acid), the scaling-up of the biosynthesis and the purification procedures were required. This could be performed after identification of the gene encoding the lysozyme sequence in Hpylori and cloning the DNA sequence of interest into a suitable expression vector and promoting high-level expression of the Lys in E. coli. Two expression systems were tested: the pGEX system yielded the Lys as fusion protein with GST, which was produced preferentially as inclusion body in E. coli host cells, especially when larger culture volumes were used. The protein was isolated from insoluble cell pellet, solubilized and successfully refolded. After purification and digestion with thrombin protease to remove the GST fusion tag from the Lys protein, tests for lytic activity were positive, even though separation could not be achieved. Binding studies performed through affinophoresis on these samples, unfortunately did not provide any evidence of the affinity of Lys fora disaccharide (LacNAc) mimicking the natural sugar substrate. The pET vector was therefore chosen for an alternative cloning strategy. The expression system gave the Lys with a C-terminai 6xHis-tag. Also in this case the protein was almost totally recovered in the insoluble fraction of the celllysate. After a refolding step, directly performed on Ni-NTA agarose affinity column, highly pure, but unactive protein was obtained. The whole work was carried out at the University of Trieste, department of Biochemistry, Biophysics and Macromolecular Chemistry in the laboratory of Prof. S.Paoletti under the supervision of Dr. A.Gamini, where I had the opportunity to learn the basic issues of analytical biochemistry. Within the Hpylori lysozyme project, a four-months stay at the Martin-Luther University of Halle-Wittenberg at the Institute of Biotechnology (Germany) in the laboratory of Prof. R.Rudolph and under the supervision of Dr. C.Lange was of great importance for getting expertise in the field of protein chemistry.