Scienze biologiche
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- PublicationA gene transfer approach, based on Adeno-Associated Viral (AAV) vectors, to study the process of vessel maturation and stabilization(Università degli studi di Trieste, 2009-04-21)
;Moimas, Silvia ;Giacca, MauroZacchigna, SerenaThe main goal of angiogenic gene therapy is the formation of functional new blood vessels adequate to restore blood flow in ischemic tissues. Angiogenesis is a complex process, consisting in the sprouting of new capillaries from pre-existing vessels to form an immature vascular network, which subsequently undergoes functional maturation and remodelling. Many factors are involved in this process and, among them, the VEGF family members are universally recognized as the key players. During my PhD I exploited gene transfer by vectors based on the Adeno-Associated Virus (AAV) to express several factors involved in the angiogenic process, in an attempt to define the molecular and cellular mechanisms of vessel maturation and stabilization. Most experiments were performed by vector injection in the mouse and rat skeletal muscle, followed by detailed histological, immunohistochemical and functional analysis. First of all the angiogenic effect driven by two main VEGF isoforms, VEGF165 and VEGF121 was compared. AAV-VEGF165 and AAV-VEGF121 appeared equally able to induce endothelial cell proliferation, leading to the formation of new CD31 positive capillaries. However, only the longest VEGF165 isoform was capable to recruit -SMA positive cells around growing capillaries and therefore giving rise to small arteries. The acquisition of a smooth muscle cell layer can be considered as marker of vessel maturation. This was also confirmed by a permeability assay, which showed that VEGF121-induced vessels were more permeable compared to those induced by VEGF165. Interestingly, the presence of -SMA positive vessels was paralleled by the recruitment of CD11b positive mononuclear cells from the bone marrow, cells which were not recruited by VEGF121. The presence of these infiltrating cells in close proximity to the newly formed arterioles suggested their possible role in smooth muscle cell recruitment and vessel maturation. Real-time PCR allowed observing that the infiltrating CD11b positive cells expressed a cocktail of cytokines implicated in vessel maturation, such as TGF- and PDGF-B. As a proof of concept of the paracrine activity of these cells in vessel maturation, we developed an AAV-PDGF-B vector, which, when co-injected with AAV-VEGF121, was arteriogenic even in absence of cellular infiltration. Thus, the expression of PDGF-B partially substitutes for the cells observed in the muscles injected by AAV-VEGF165 to form arterial vessels. To verify the functionality of the vessels induced by AAV-VEGF165 we delivered this vector to different animal models of tissue ischemia: a flap ischemia model and an in vivo chamber for tissue engineering based on an artero-venous loop. In both the models, VEGF165 expression induced the formation of -SMA positive vessels, which turned out to improve flap survival in the flap models, and to promote the formation of new vascularized tissue in the chamber. Despite the presence of several arteries, other vessels formed by VEGF165 were abnormally enlarged and leaky, often forming vascular lacunae. This observation indicated that VEGF gene transfer might not be sufficient for the formation of a fully functional vascular network, and that other factors might be required in order to achieve functional competence of the neovessels. We observed that the combined expression of VEGF165 with Angiopoietin-1, which is known to stabilize endothelial and mural cell interactions, resulted in a significant reduction of vessel permeability and improved blood flow, as assessed by positron emission tomography (PET) and single photon emission tomography (SPECT). These findings reveal that a fine control of the expression of angiogenic factors is needed to achieve the formation of stable and functional vessels. The presence of -SMA positive cells might be considered as a first step in vessel maturation but further stabilization factors have to take part to the process in order to tighten the cell-cell junctions. Moreover, we showed that a detailed histological and functional analysis ex vivo might not be sufficient to characterized the new vasculature, requiring imaging techniques such as PET or SPECT.1342 4643 - PublicationA mutant p53/miR-30d axis controls cell polarity in Breast Cancer(Università degli studi di Trieste, 2014-04-28)
;Capaci, ValeriaDel Sal, GianninoTriple-negative breast cancer (TNBC) is a subtype of breast cancer (BC) characterized by highly aggressive phenotype, unfavorable prognosis and lack of specific therapy. At the molecular level TNBC resembles basal-like subtype of BC, characterized by high prevalence of missense point mutations in the TP53 gene, one of the most frequent genetic events in human cancers. Mutant-p53 proteins on one hand lose wild-type tumor suppressive functions but, on the other, acquire oncogenic properties (“gain-of-function”, GOF) that actively contribute to tumorigenesis. Studies in aggressive breast cancer-derived cell lines underscored a central role of mut-p53 in cell-polarity disruption and acquisition of highly aggressive phenotype. Increasing knowledge about the mechanism that regulates the establishment and maintenance of cell polarity, have reveled its important contributions in preventing acquisition of tumorigenic features, but it is still challenging to understand how cancer genes and pathway influence epithelial architecture. Despite the increasing knowledge of mut-p53 functions, little is known about microRNAs associated with mut-p53. Here we investigated whether mut-p53 GOFs exerted in TNBC could be in part mediated by miRNAs whose expression is promoted mut-p53. In MDA-MB-231 (TNBC cells harboring endogenous mut-p53) we performed a screening of miRNAs previously described to be overexpressed in BC and other solid tumors. Among miRNAs positively regulated by mut-p53 we identified miR-30d. Results of further experiments suggest that mut-p53/miR-30d axis plays an important role in inducing epithelial cell polarity disruption and causes aggressive cancer phenotypes, such as cellular migration and invasion. We also identified and validated targets of the mutp53/miR-30d axis that could be involved in mediating their biological effects. In particular we identified DLG5 as a key gene whose suppression by mut-p53/miR-30d seems to be correlated with epithelial cell polarity disruption and causes cancer aggressiveness. We propose that understanding pathways affected by miR-30d will provide new insights that can be exploited in discovery of novel therapeutic targets and diagnostic markers in TNBC.1266 1442 - PublicationA new animal model in the study of UCB metabolism and neurotoxicity(Università degli studi di Trieste, 2009-03-02)
;Bortolussi, Giulia ;Tiribelli, ClaudioMuro, Andres FernandoHyperbilirubinemia is the most common clinical situation during neonatal life and it is observed in 60% of full−term and 80% of pre−term infants. A combination of factors still not well defined such as: prematurity, infections, genetic disorders, brest-feed under-nourishing, may cause hazardous, toxic levels of UnConjugated Bilirubin (UCB) during neonatal period (neonatal jaundice) that pose a direct threat of brain bamage (kernicterus). The deposition of UCB in the Central Nervous System (CNS) causes Bilirubin Encephalopathy (BE) with lifelong motor, auditory and mental impairment. The in vivo knowledge on kernicterus derives almost totally from the investigation on Gunn rat that is a natural model for BE. In this animal model the genetic lesion are closely parallel those present in the Crigler-Najjar syndrome type I and the neuropathological lesions are also similar to those found in humans. The Gunn rat is a mutant strain of Wistar rats that lack the uridin di phospho glucoronosyl transferase (UDPGT) activity toward bilirubin. Although the Gunn rat the classical laboratory model for bilirubin encephalopathy its use for the study of molecular mechanisms involved and the determination of other genes modulating the disease is limited by the existence of different strains and by the impossibility to generate targeted mutations in rats, preventing the in vivo study of the role of other genes in BE (i.e. Mrp1). The aim of my PhD project was to generate a mouse model of hyperbilirubinemia due to a one base deletion in the UGT1a1 gene, identical to the one present in the Gunn rat. To reach this goal, we took advantage to the “Gene Targeting” technique. This genetic technique uses the homologous recombination to modify an endogenous gene. First we constructed the targeting vector specific for the gene of interest. To target genes in mice, the targeting vector was inserted into mouse embryonic stem cells (ES) in culture. At the same time we set up two screening strategies to verify the presence of the targeted mutation in electroporated ES cells (Southern blot and Multiplex PCR). Two positive clones were identified (A9 and G7). Then the positive ES clones were amplified and injected into the blastocysts. Blastocysts were implanted in to a foster mother to obtain the so-called “chimera.” Chimeric mice have two different populations of genetically distinct type of cells originated from different mouse strains and can be selected by the fur colour. We obtained two chimeras, one deriving from A9 clone and one from G7. These chimeras were mated with wild type mice to check for germ line transmission. If the modified ES cells made up the reproductive organ, the offspring will inherit the mutated allele (heterozygous). At the present time we are screening the offspring of the chimeras, to check for germ line transmission. Mating the heterozygous mice, the offspring will have the entire body based on the previously mutated embryonic stem cell (homozygous). Obtaining this new animal model for bilirubin neurotoxicity (Gunn mouse) will be crucial to understand the mechanisms regulating the disease, together with an improvement of the diagnosis, prediction of the prognosis, and development of new therapeutic strategies.1251 929 - PublicationA Pin1/mutant p53 axis promotes aggressiveness in breast cancer(Università degli studi di Trieste, 2011-04-28)
;Napoli, Marco ;Del Sal, GianninoGirardini, JavierMutations in the TP53 gene are among the most frequent genetic alterations in human cancers. As a consequence of these mutations p53 loses its tumour suppressor functions and may acquire novel oncogenic activities (gain of function) sustaining tumour formation and progression. Many in vivo studies highlighted that mutant p53 gain of function is associated with elevated protein levels, supporting the notion that in tumour cells altered signalling could stabilize and activate mutant p53, with mechanisms similar to those required to stimulate wild-type p53. The aim of my PhD work was to investigate the mechanisms underlying mutant p53 gain of function, focusing on factors that might link cancer-related signalling with mutant p53 activity. An intriguing candidate for this role is the phosphorylationdependent prolyl isomerase Pin1, that transduces phosphorylation signalling into conformational changes affecting the functions of its substrates, as ours and other laboratories have reported for wild-type p53. Despite Pin1 supports wild-type p53 functions, Pin1 is frequently overexpressed in human tumours and has been shown to promote both Her2/Neu/Ras and Notch1 dependent transformation. So we reasoned that the physiological role of Pin1 as a component of checkpoint mechanisms might be subverted during tumourigenesis, thereby turning it into an essential partner of mutant p53 and a critical amplifier of its oncogenic functions. Indeed, we now demonstrate that Pin1 enhances tumourigenesis in a Li-Fraumeni mouse model and cooperates with mutant p53 in Ras-dependent cell transformation. In human breast cancer cells, Pin1 promotes both mutant p53 dependent inhibition of the anti-metastatic factor p63 and the induction of a mutant p53 transcriptional program to increase tumor aggressiveness. Accordingly, we have identified a transcriptional signature (the Pin1/mutant p53 signature) that is associated with poor prognosis in breast cancer and, in a cohort of patients, Pin1 over-expression influences the prognostic value of p53 mutation. Considering that TP53 mutation is more frequent in tumors with higher risk of recurrence such as triple-negative cases and that some of the Pin1/mutant p53 signature genes are over-expressed in triple negative breast cancers, our findings carry therapeutic implications for this kind of cancers and possibly also for other tumours bearing mutant p53 and high levels of Pin1.1640 2363 - PublicationActivity of salmonid antibacterial proteins and regulation of their expression in response to pathogens(Università degli studi di Trieste, 2014-04-11)
;Furlan, Michela ;Pallavicini, AlbertoScocchi, MarcoCathelicidins are an important family of antimicrobial peptides involved in the innate immune system and have been discovered quite recently in teleost. Differently from the well-studied mammal cathelicidins, information about their structural and functional characteristics and the tissue expression and localization are yet scattered or inconsistent in fish and in particular in salmonids. The present work highlights some characteristics of salmonid cathelicidins. Results indicate that fragments of the C-terminal domain own a wide-spectrum, salt-sensitive antibacterial activity especially against Aeromonas salmonicida and Lactococcus garvieae fish pathogens. Even if these peptides adopt a random-coiled structure, rather than a more usual organised conformation, they are able to highly permeabilize bacteria cell membranes within 15 minutes, resulting highly selective for prokaryotic targets and with no cytotoxic effect towards eukaryotic cells. Importantly, we have shown that the antibacterial activity is directly correlated with the presence of the KIRT cationic motif at the N-terminus of the antimicrobial domain and with the length of the peptides. Regarding the basal expression of endogenous salmonid cath genes, rtcath_1 has been found to be constitutively present at higher level than rtcath_2 in all the analysed tissues both using RNA-seq and real-time PCR methods. I.p. inoculum of inactivated bacteria in trout was able to stimulate rtcath_1 and rtcath_2 expression together with other genes encoding for the acute phase proteins already within 24 hours from the bacterial cells injection. Among them, rtcath_2 was one of the most highly up-regulated genes. Interestingly, rtcath genes remained up-regulated at least 4 days after the challenge, with differences in expression level among tissues and depending on the diverse pathogen used as stimulus. Endogenous Cath protein expression in tissue was also evaluated using a specific antibody raised against a full length recombinant cathelicidin of rainbow trout that was produced in bacteria. Preliminary data identify some bands consistent with this protein in head kidney and spleen, but additional work has to be done to confirm the results. These findings indicate that Cath peptides are endogenous antibiotics and an important element of salmonid innate immune response. Cathelicidin up-regulation might be exploited in the protection of salmonids from infection and at the same time they may be used as antibiotics for fighting fish pathogens in aquaculture.810 100 - PublicationAlterazione dell'espressione genica in mitili contaminati con acido Okadaico e Dinofisitossine(Università degli studi di Trieste, 2011-04-22)
;Manfrin, ChiaraPallavicini, AlbertoGli aumenti stagionali delle temperature dei mari sono tra le condizioni ottimali di crescita per i Dinoflagellati, i quali possono raggiungere elevate concentrazioni nella colonna d’acqua e negli organismi filtratori come in Mytilus galloprovincialis. Alcuni dinoflagellati, comunemente Dinophysis e Prorocentrum spp., sono conosciuti produttori di acido okadaico (OA) e dei suoi analoghi che sono responsabili della sindrome diarroica (Diarrheic Shellfish Poisoning (DSP)) nell’uomo. Quando i livelli delle tossine DSP nei mitili eccedono i 16 μg su 100 g di polpa, le mitilicolture vengono chiuse e le vendite dei molluschi sono bloccate. Risulta chiaro che nonostante non siano mai state registrate mortalità negli uomini o nei mitili, gli eventi DSP provocano importanti problemi sanitari ed economici in tutto il settore dell’acquacoltura. Questo lavoro suddiviso in 3 parti ha, dapprima sondato l’applicabilità di metodiche molecolari, quali l’impiego di un microarray (MytArray 1.0) e le validazioni in PCR real time quantitativa (qRT PCR), per la rilevazione delle modifiche dei profili trascrizionali indotte dalla presenza delle biotossine DSP. Questa prima parte ha fornito una lista di geni attivati o silenziati nel corso di un esperimento durato 35 giorni in mitili mantenuti a condizioni costanti e contaminati con OA. Sebbene le condizioni di mantenimento non rappresentino le situazioni alle quali i mitili sono sottoposti in natura, ciò ha permesso un’analisi preliminare dei putativi effetti indotti dall’acido okadaico (OA). L’insieme dei trascritti differenzialmente espressi ha consentito di avere una panoramica di quelli che sono i pattern molecolari maggiormente influenzati dalla presenza della biotossina. Al fine di validare i risultati ottenuti dalle ibridazioni sul MytArray 1.0 e per poter individuare putativi biomarker di OA si è proceduto a validare alcuni trascritti attraverso qRT PCR. Questa analisi ci ha consentito di osservare i livelli di espressione dei singoli trascritti selezionati e non ultimo di validare o meno i risultati ottenuti dal MytArray 1.0. La disponibilità dei Dott Zanolin e Franceschini ha reso possibile sondare i trascritti ritenuti putativi marker di OA in campioni naturalmente contaminati. 14 trascritti sono stati analizzati nei campioni provenienti da varie zone del Golfo di Trieste. Questa seconda parte del lavoro è stata indispensabile e scientificamente necessaria per poter discriminare i trascritti differenzialmente espressi a seguito della presenza di tossine DSP o a causa del mantenimento in condizioni controllate dei mitili, nell’esperimento iniziale. L’individuazione di pattern molecolari comuni ai campioni naturalmente contaminati e raccolti in anni diversi e ai profili di espressione ottenuti nello studio iniziale, è un punto di partenza interessante per la ricerca indirizzata all’individuazione di un set di trascritti attivati in modo specifico dalla presenza di tossine DSP e rafforza la validità dell’utilizzo di approcci molecolari negli studi di biomonitoraggio ambientale. Non ultimo l’analisi dei trascritti proteici che costituisce un altro aspetto importante della ricerca volta all’individuazione di trascritti attivati e specificatamente correlati alla presenza di tossine DSP. La sinergia dei metodi di rilevamento applicati di routine per l’accertamento della presenza di biotossine, supportato da metodiche di indagine genetica o estese al trascrittoma dell’organismo oggetto di studio, permetterebbero l’individuazione di contaminazioni a livelli sicuramente inferiori rispetto a quelli che sono i limiti di sensibilità dei test oggi applicati. L’applicazione di metodiche molecolari di questo tipo è d’uso crescente in analisi di biomonitoraggio ambientale supportando la validità e la robustezza dei risultati che questi approcci forniscono. In un lasso relativamente breve di 3 anni è stato possibile ottenere e validare un set di risultati correlati alla risposta genica del mitilo sottoposto a contaminazione con tossine DSP. Le problematiche connesse agli eventi di DSP nel nostro Golfo, legato alle pesanti perdite economiche che derivano dalle chiusure delle mitilicolture in alcuni periodi dell’anno e la mancanza di metodiche di rilevamento ad oggi completamente accettate dalla Comunità Scientifica, pongono le metodologie di analisi impiegate in questo studio, tra le più interessanti e sensibili nella rilevazione di situazioni di stress ambientale.1523 8546 - PublicationAn investigation in the use of advanced remote sensing and geographic information system techniques for post-fire impact assessment on vegetation.(Università degli studi di Trieste, 2008-04-15)
;Mitri, Georges Habib ;Feoli, EnricoGitas, IoannisGli incendi boschivi rappresentano uno dei maggiori problemi ambientali nella regione Mediterranea con vaste superfici colpite ogni estate. Una stima dell’impatto ambientale degli incendi (a breve e a lungo termine) richiede la raccolta di informazioni accurate post-incendio relative al tipo di incendio, all’intensità, alla rigenerazione forestale ed al ripristino della vegetazione. L’utilizzo di tecniche avanzate di telerilevamento può fornire un valido strumento per lo studio di questi fenomeni. L’importanza di queste ricerche è stata più volte sottolineata dalla Commissione Europea che si è concentrata sullo studio degli incendi boschivi ed il loro effetto sulla vegetazione attraverso lo sviluppo di adeguati metodi di stima dell’impatto e di mitigazione. Scopo di questo lavoro è la stima dell’impatto post-incendio sulla vegetazione in ambiente Mediterraneo per mezzo di immagini satellitari ad alta risoluzione, di rilievi a terra e mediante tecniche avanzate di analisi dei dati. Il lavoro ha riguardato lo sviluppo di un sistema per l’integrazione di dati telerilevati ad altissima risoluzione spaziale e spettrale. Per la stima dell’impatto a breve termine, un modello di classificazione ad oggetti è stato sviluppato utilizzando immagini Ikonos ad altissima risoluzione spaziale per cartografare il tipo di incendio, differenziando l’incendio radente dall’incendio di chioma. I risultati mostrano che la classificazione ad oggetti potrebbe essere utilizzata per distinguere con elevata accuratezza (87% di accuratezza complessiva) le due tipologie di incendio, in particolare nei boschi Mediterranei aperti. È stata inoltre valutata la capacità della classificazione ad oggetti di distinguere e cartografare tre livelli di intensità del fuoco utilizzando le immagini Ikonos e l’accuratezza del risultato è stimata all’ 83%. Per la stima dell’impatto a lungo termine, la mappatura della rigenerazione post-incendio (pino) e la ripresa della vegetazione arbustiva sono state valutate mediante tre approcci: 1) la classificazione ad oggetti di immagini ad altissima risoluzione QuickBird che ha permesso di mappare la ripresa della vegetazione e l’impatto sulla copertura a seguito dell’incendio distinguendo due livelli di intensità dell’incendio (accuratezza della classificazione 86%). 2) l’analisi statistica di dati iperspettrali rilevati in campo che ha permesso una riduzione del 97% del volume di dati e la selezione delle migliori 14 bande per discriminare l’età e le specie di pino e le 18 migliori bande per la caratterizzazione delle specie arbustive. Successivamente, i dati iperspettrali Hyperion sono stati utlizzati per mappare la rigenerazione forestale e la ripresa della vegetazione. L’accuratezza complessiva della classificazione è stata del 75.1% considerando due diverse specie di pino ed altre specie vegetali. 3) una classificazione ad oggetti che ha combinato l’analisi dei dati QuickBird ed Hyperion. Si è registrato un aumento dell’accuratezza della classificazione pari all’8.06% rispetto all’utilizzo dei soli dati Hyperion. Complessivamente, si osserva che strumenti avanzati di telerilevamento consentono di raccogliere le informazioni relative alle aree incendiate, la rigenerazione forestale e la ripresa della vegetazione in modo accurato e vantaggioso in termini di costi e tempi.1144 2328 - PublicationAnalisi dei movimenti spazio-temporali di uccelli acquatici svernati nelle zone umide dell'alto Adriatico(Università degli studi di Trieste, 2009-04-16)
;Campomori, Chiara ;Ferrero, Enrico ;Serra, LorenzoSponza, StefanoLe zone umide costiere dell’Alto Adriatico sono siti di grande importanza per lo svernamento di molte specie di uccelli acquatici. Gli uccelli acquatici possono essere considerati dei validi bioindicatori ambientali di queste aree, da cui essi dipendono in tutte le fasi del loro ciclo biologico. La conoscenza dei movimenti spazio-temporali dell’avifauna acquatica è un elemento essenziale per una corretta gestione delle zone umide e per lo sviluppo di adeguate politiche di conservazione. A tale scopo, è stato studiato il comportamento spazio-temporale degli uccelli acquatici a scala globale (variabilità intra- ed inter-annuale), a scala regionale (distribuzione nelle zone umide dell’alto Adriatico) ed scala locale (uso dello spazio e dell’habitat). In considerazione della notevole variabilità comportamentale che gli uccelli dimostrano ad ogni scala spazio-temporale, sono stati studiati i limiti e le dimensioni di queste variazioni in alcune specie di uccelli acquatici svernanti nell’Alto Adriatico, cercando di comprendere quale parte di questa variabilità è casuale e quale origina da risposte adattative a fattori ecologici. Come specie target è stato scelto il Piovanello pancianera Calidris alpina. Si è cercato, inoltre, di fornire alcune indicazioni per la gestione di queste zone umide e per una corretta metodologia di rilevamento e utilizzo dei dati di censimento.1233 5649 - PublicationAnalisi della comunità macrozoobentonica e del suo contenuto energetico in una zona umida dell’alto Adriatico (Isola della Cona, GO)(Università degli studi di Trieste, 2013-03-25)
;Bertoli, MarcoPizzul, ElisabettaIl presente lavoro è stato condotto nella Riserva Naturale della Foce dell’Isonzo, in un'area caratterizzata da un ampio invaso d’acqua dolce, soggetto a prosciugamento in periodo estivo. Lo scopo di questo studio è stato quello di analizzare struttura ed abbondanza della comunità macrozoobentonica e valutare il contenuto energetico dei taxa più rappresentativi, in relazione all’importante ruolo che questa comunità assume da un punto di vista trofico in questi ambienti. I macroinvertebrati bentonici ricoprono tutti i ruoli trofici dei consumatori e sono la componente più importante della dieta di Pesci ed Uccelli limicoli. Sono state scelte 5 stazioni di campionamento sulla base della diversa profondità dell’acqua, diversa copertura vegetale del substrato e diversa durata della fase bagnata. Mensilmente, a partire dal gennaio 2009 fino a ottobre 2012 è stata rilevata la profondità assieme ad alcuni parametri chimico-fisici, quali: ossigeno disciolto (mg l-1), temperatura (°C), pH e conduttività (mS cm-1). I dati evidenziano per la profondità una tendenza inversa rispetto alla temperatura, legata al ciclo stagionale di prosciugamento/riallagamento a cui è soggetta l’area di studio, e tra temperatura e ossigeno disciolto. La conduttività tende ad aumentare in corrispondenza dell’aumento di temperatura in estate, mente il pH si mantiene su valori neutri tendenti leggermente al basico, oscillando entro un range piuttosto ristretto. Durante l’ultimo anno di attività (novembre 2011-ottobre 2012) sono state monitorate le concentrazioni di alcuni nutrienti (mg l-1), quali NH4, NO3, NO2, PO4, all’interno del sedimento. Per tale scopo sono stati prelevati mensilmente campioni di sedimento mediante un carotiere manuale, e stagionalmente campioni a carico della colonna d’acqua. I risultati denunciano un’alta concentrazione di nutrienti, in particolare dei composti dell’azoto, rispetto a quanto atteso in ambienti dilciacquicoli, verosimilmente, in relazione al carico organico dovuto alla presenza dell’avifauna nell’area di studio. Allo scopo di effettuare analisi granulometriche e misurazioni del C organico, nell’inverno ed autunno 2009, sono stati analizzati campioni di sedimento, in collaborazione con il Dipartimento di Matematica e Geoscienze dell’Università di Trieste. Le analisi granulometriche hanno evidenziato in febbraio la presenza di silt sabbioso in tutte le stazioni, ad eccezione della stazione 2, in cui è stato invece rinvenuto silt argilloso. In ottobre anche nelle stazioni 3 e 4 è stato osservato silt argilloso, mentre non vi sono variazioni nelle restanti stazioni. L’analisi del carbonio organico mostra sempre valori simili nei due campionamenti, con valori più alti nella stazione 1 (3,29% in febbraio, 3,93% in ottobre) e più bassi nelle stazioni 2 e 5 (rispettivamente 1,73% e 1,71% in febbraio e 1,18% e 1,14% in ottobre). Per quanto attiene le comunità macrozoobentoniche, sono stati effettuati campionamenti mediante utilizzo di due tecniche: 1) mediante box corer manuale, strumento dotato di un’area di presa definita (289 cm²), che garantisce un campionamento di tipo quantitativo e minimizza le perdite del campione; 2) tramite la tecnica dei pacchetti fogliari che simulano il naturale accumulo di detrito e che permettono di analizzare i processi decompositivi ed i taxa che riescono a colonizzare i pacchetti. I campionamenti che hanno visto l’utilizzo del box corer si sono svolti nell’aprile 2009 e a cavallo tra ottobre e novembre 2009, e hanno visto il prelievo di 6 subcampionamenti per stazione. La determinazione tassonomica si è spinta fino a livello di famiglia o di genere e, per alcuni taxa raccolti nella primavera, a livello di specie, grazie anche alla collaborazione della Dott.ssa Boggero (CNR, Pallanza) e del Prof. Rossaro (Università di Milano). Le campagne di campionamento mediante pacchi fogliari si sono svolte per tre anni consecutivi, dall’autunno 2009 all’estate 2012, durante le stagioni autunnale, primaverile ed estiva. I pacchi sono stati realizzati con foglie di Phragmites australis, raccolte all’interno della Riserva, seguendo il protocollo indicato da Basset et al., 2006. Sono state organizzate tre unità subcampionarie per ogni stazione, messe in posa con evento unico e raccolte a scaglioni (una per stazione) con cadenza quindicinale. Dopo la raccolta i macroinvertebrati sono stati separati immediatamente dalla componente fogliare, in attesa della determinazione che si è spinta allo stesso livello indicato per i campioni raccolti con box-corer. La struttura della comunità macrozoobentonica è risultata esser costituita principalmente da Crostacei (Classe Ostracoda, famiglie Asellidae e Gammaridae), Oligocheti (famiglie Lumbricidae, Tubificidae, Naididae) ed Insetti. Tra questi ultimi il taxon dominante è risultato essere quello dei Ditteri Chironomidi, i quali rappresentano sempre oltre il 90% degli Insetti rinvenuti. Tale strutura di comunità è stata riscontrata, pur variando i rapporti tra le frequenze percentuali dei vari taxa, nelle diverse stagioni, con entrambi i metodi di campionamento. Numerosità e diversità (espressa come numero dei taxa rinvenuti) sono risultate maggiori durante la primavera rispetto all’autunno, sia nei campioni raccolti con box corer che con le trappole trofiche. Sulla base dei pesi dei pacchetti fogliari post periodo di permanenza nelle stazioni sono stati calcolati i tassi di decomposizione della sostanza organica vegetale (gg-1), utilizzando il modello di Olson (1963). Il modello è stato trasformato da esponenziale a lineare e sono stati effettuati dei confronti a livello inter- e intrastagionale mediante analogo dell’ ANCOVA. La pianificazione del protocollo di campionamento è stata organizzata con la collaborazione con il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali dell’Università degli Studi del Salento. Il tasso di decomposizione della sostanza organica vegetale è risultato esser compreso tra 0,0066 e 0,0075 gg-1 in autunno e tra 0,0108 e 0,0158 gg-1 in primavera. I confronti hanno permesso di mettere in evidenza differenze significative tra i tassi di decomposizione autunnale e primaverile per ogni anno di attività (p>0,05). Non sono state osservate differenze significative tra i tassi autunnali, mentre tali differenze sono sempre emerse a livello della stagione primaverile (p<0,0001). Le campagne di campionamento estive non sono state completate con successo a causa del prosciugamento dell’area, per cui non è stato possibile effettuare paragoni. Confronti intra stagionali non hanno evidenziato (salvo due eccezioni) differenze tra le stazioni (p>0,05). Si può concludere quindi che il sistema degrada la sostanza organica vegetale alla stessa velocità in ogni sua parte nelle stagioni esaminate. Per i taxa per cui numerosità e peso secco lo hanno reso possibile, (Ditteri Chironimidi appartenenti alla tribù dei Chironomini e due famiglie di Crostacei: Gammaridae e Asellidae) sono state effettuate misure a carico della densità energetica ED (cal g-1, peso secco). I taxa sono stati trattati in stufa a 60 °C per 72 ore e in seguito polverizzati. Con il materiale ottenuto sono state prodotte delle pastiglie in seguito processate in un calorimetro adiabatico a bomba Parr 1425 (Parr Instrument Company, U.S.A.). I valori ottenuti sono stati confrontati (quando possibile) mediante statistica non parametrica (test di Kruskal e Wallis per i Chironomini e test U di Mann e Whitney per i Gammaridae), allo scopo di indagare differenze stagionali tra i valori di ogni taxon. Le misure sono state effettuate presso il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali dell’Università degli Studi del Salento. I valori di densità energetica per la tribù dei Chironomini sono risultati esser compresi tra 3398,7 cal g-1 (valore autunnale) e 3483,6 cal g-1 (valore primaverile), mentre per i Gammaridae i valori sono risultati pari a 3863,7 cal g-1 in primavera e 40008,6 cal g-1 in autunno. Il valore della densità energetica per il taxon degli Asellidi è risultato pari a 3856,1 cal g-1 . Non è stato possibile evidenziare differenze significative a livello stagionale né per i Chironomini né per i Gammaridae. Per la tribù dei Chironomini e la famiglia dei Gammaridae sono state costruite curve di regressione lunghezza/peso secco. Per tale scopo è stata rilevata la lunghezza L (mm) ed è stato misurato o stimato il peso secco DW (g) per almeno 50 esemplari per ciascun taxon. Dall’analisi delle comunità macrozoobentoniche osservate all’interno del Ripristino emerge come il sistema rappresentato da quest’area sia assimilabile a una sorta di “laboratorio naturale” che torna praticamente a una condizione di “zero” a seguito del prosciugamento che avviene durante i mesi estivi. Al termine della fase secca, segue una fase di riallagamento, che si completa durante la stagione autunnale, con conseguente ricolonizzazione dei microhabitat da parte dei macroinvertebrati. La ricolonizzazione porta però a strutture di popolazione che possono essere ben diverse da quelle osservate in precedenza. Si può quindi affermare che il Ripristino è un sistema in uno stato di “perenne ricolonizzazione”. Questa conclusione è ulteriormente supportata dall’analisi dei tassi di decomposizione, i quali sono risultati esser praticamente identici nella stagione autunnale (a seguito dell’azzeramento del sistema) e sempre diversi in primavera, variando di anno in anno. I risultati fin qui ottenuti, forniscono nuove conoscenze riguardo ad aspetti finora poco studiati nell’area di studio (tassi di decomposizione della sostanza organica vegetale e densità energetice dei macroinvertebrati bentonici), e supportano la teoria secondi cui il mondo ecologico è un mondo di “non-equilibrio”, in cui i fenomeni di disturbo sono comuni e possono esser sempre diversi di volta. Questi fenomeni, possono portare a direzioni non facilmente prevedibili, e ogni ecosistema è dunque unico, irriproducibile e intendibile come fenimeno pro tempore.1099 2165 - PublicationAnalisi e gestione informatica di sequenze trascritte in organismi non-modello(Università degli studi di Trieste, 2013-03-25)
;De Moro, GianlucaPallavicini, AlbertoIl tema principale di questo lavoro di tesi è la discussione dei metodi che, mediante l’utilizzo di strumenti creati ad-hoc e di software di terze parti, hanno permesso analizzare sequenze trascritte di 5 organismi non-modello: Mytilus galloprovincialis, Ruditapes philippinarum, Latimeria menadoensis, Astacus leptodactylus e Procambarus clarkii.926 4658 - PublicationAnalisi e modellazione di caratteristiche biogeochimiche ed ecologiche in acque costiere del Nord Adriatico(2007-05-30T06:13:54Z)
;BANDELJ, VINKOSOLIDORO, COSIMOIl presente lavoro di dottorato ha avuto come obiettivo l'identificazione e l'interpretazione di situazioni di riferimento e di relazioni tra caratteristiche abiotiche e caratteristiche biotiche in ambienti marini costieri, attraverso l'uso di metodi multivariati tradizionali e di metodi basati sulle reti neurali per la classificazione, l'analisi di gradiente e la modellazione di dati ambientali. Il crescente interesse per gli ambienti marini e in particolare per le aree costiere nasce dall'importanza che tali aree hanno per la vita dell'uomo, e dalla considerazione che esse sono soggette a molteplici impatti antropici che interagiscono con le grandi eterogeneità e variabilità intrinseche degli agenti forzanti naturali degli ambienti costieri. In particolare le aree costiere sono interessate da elevata densità abitativa, sono sede di attività portuali ed industriali, di attività di pesca ed acquacoltura e di attività turistiche. Le esigenze contrastanti di tali attività devono inoltre permettere una fruizione senza rischi delle aree marine costiere per attività di diporto e di tempo libero, e spesso tutto ciò è in contrasto con le esigenze di conservazione del loro valore naturalistico, paesaggistico, storico ed artistico. Per una corretta implementazione di politiche di conservazione biologica, gestione e recupero ambientale è dunque necessaria l'identificazione di situazioni di riferimento, e la descrizione della loro evoluzione nel tempo e nello spazio, contro di cui confrontare la situazione attuale o gli obiettivi di ripristino posti dalla legislazione. L'importanza di tale obiettivo è riconosciuta nell'ambito scientifico internazionale e recepita da recenti disposizioni legislative. In particolare la direttiva europea 2000/60/CE prevede che siano effettuate analisi delle caratteristiche dei diversi corpi d'acqua e che siano definite delle condizioni di riferimento tipiche specifiche per ognuno di essi. Gli elementi da considerare per le acque costiere e le acque di transizione per raggiungere tali obiettivi includono la composizione e le abbondanze delle popolazioni planctoniche e bentoniche, i parametri chimico-fisici e le condizioni morfologiche. Nel presente lavoro di ricerca sono stati analizzati dataset riferiti ad ambienti costieri e di transizione dell'Adriatico settentrionale. Secondo la disponibilità di dati, tali dataset contenevano variabili chimico-fisiche (p.es. temperatura, salinità, nutrienti), morfologiche (p.es. profondità), idrodinamiche (p.es. tempi di residenza) e biologiche (p.es. abbondanze planctoniche, ricoprimenti bentonici). L'obiettivo delle analisi sui dataset di parametri chimico-fisici è consistito nell'identificazione di masse d'acqua omogenee, che consiste nell'individuazione del numero delle masse d'acqua, nella descrizione delle loro caratteristiche in funzione delle variabili utilizzate, nella derivazione di una loro evoluzione spazio-temporale tipica, e nell'interpretazione della loro dinamica in funzione di fenomeni e forzanti noti. A tal fine sono stati utilizzati soprattutto metodi multivariati di ordinamento e clusterizzazione, quali k-means, Self-Organizing Map, fuzzy k-means. L'obiettivo dell'analisi su dati biologici era l'identificazione e la descrizione di biocenosi caratteristiche di una certa area e momento. I dati biologici erano riferiti ad organismi appartenenti ad un unico comparto trofico (p.es. autotrofi), oppure ad organismi di comparti trofici diversi. In generale, si è cercato di caratterizzare ogni biocenosi attraverso l'individuazione delle specie caratteristiche, cioè quelle che indicano il verificarsi di determinate condizioni ambientali, e delle specie dominanti, cioè quelle che maggiormente contribuiscono ai flussi di materia ed energia in ogni biocenosi. Un ulteriore obiettivo è stata la ricerca di relazioni tra biocenosi e variabili chimicofisiche e spazio-temporali, e l'interpretazione di tali relazioni secondo plausibili modelli causali. Per questi fini sono stati utilizzati metodi di analisi di gradiente indiretta (clusterizzazione e ricerca relazioni con variabili), metodi di analisi di gradiente diretta (Redundancy Analysis, Canonical Correspondence Analysis) e metodi di predizione (Backpropagation Neural Network). Il lavoro si è quindi articolato in diverse fasi nel corso delle quali sono stati considerati aree e metodologie diverse in funzione della disponibilità ed accessibilità di dati storici o attuali. Per analizzare dataset molto diversi tra loro è stato necessario l'utilizzo e la messa a punto di strumenti avanzati di analisi e modellamento dei dati e di presentazione dei risultati. I problemi più frequentemente incontrati erano legati alla tipologia dei dataset disponibili, quasi mai costruiti con lo scopo di testare un'ipotesi precisa, ma risultanti piuttosto da fusioni a posteriori di insiemi di dati raccolti nel corso di progetti diversi, con finalità , metodologie e disegni sperimentali differenti. Molte volte i dati sono stati raccolti con una copertura insufficiente nella dimensione spaziale o temporale, che ha reso quindi difficoltosa l'applicazione di metodi statistici rigorosi e la generalizzazione dei risultati nel dominio del tempo e dello spazio. In fase di pretrattamento è stato sovente necessario ricorrere a procedure di trasformazione e di aggregazione dei dati, e di codifica di alcuni parametri in variabili qualitative. Le variabili biologiche hanno presentato ulteriori problemi data la stocasticità dei fenomeni biologici, l'incertezza nella determinazione di alcune specie e la conseguente eterogeneità e complessità dei dataset. La scelta della metrica opportuna è stata quindi un passo necessario in tutte le analisi su dati biologici. In particolare gli studi effettuati nel lavoro di dottorato ed esposti nella presente tesi sono i seguenti: studio sulle masse d'acqua del golfo di Trieste e della laguna di Venezia in base ai parametri chimico-fisici; studio su 10 anni di popolazioni fitoplanctoniche lungo la fascia costiera del Veneto e su 30 anni di campionamenti di popolazioni fito e zooplanctoniche nella laguna di Venezia; studio sulle comunità planctoniche multitrofiche nella laguna di Venezia; studio sulle comunità fito e zoobentoniche nella laguna di Venezia.1268 5972 - PublicationAnalysis of the molecular mechanisms of BDNF mRNA localization and traslation in neurons(Università degli studi di Trieste, 2010-03-16)
;Vicario, AnnalisaTongiorgi, EnricoLa regolazione dell’espressione genica rappresenta uno fenomeno fondamentale per garantire la sopravvivenza e la corretta funzione cellulare. In strutture complesse ed altamente specializzate come il sistema nervoso, la grande varietà morfologica e funzionale, la rapidità di interscambio di comunicazioni e di adattamento richiede un’altrettanto fine regolazione spazio-temporale dell’espressione genica. I livelli di regolazione sono molteplici e includono lo splicing alternativo, la regolazione del turnover degli mRNA, modifiche post-traduzionali ed il controllo traduzionale. La segregazione dei trascritti in diversi compartimenti subcellulari rappresenta un ulteriore meccanismo che permette di concentrare le proteine in specifici domini cellulari mediante traduzione localizzata. A partire dagli anni ’80 sono stati scoperti numerosi mRNA a livello dendritico, tra cui i trascritti codificanti Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) ed il suo recettore TrkB (Tongiorgi et al., 1997). L’mRNA per BDNF si localizza nei dendriti in risposta all‘attività elettrica e al BDNF in vitro e in seguito a crisi epilettogeniche indotte in vivo (Tongiorgi et al., 1997, 2004; Righi et al., 2000). La segregazione degli mRNA nei neuriti presuppone la potenziale traduzione in loco a seguito di specifici stimoli. A tal supporto vi è la dimostrazione della presenza di fattori coinvolti nella sintesi proteica (poliribosmi, tRNA, eIFs, eEFs, marker del reticolo endoplasmatico e del golgi) alla base delle spine dendritiche (Steward and Levi,1982; Tiedge and Brosius, 1996). Le dinamiche del trasporto coinvolgono elementi in trans, le RNA binding proteins, , ed elementi in cis, riconosciuti dalle proteine di trasporto. Questi ultimi sono solitamente confinati nella regione 3’UTR (Bashirullah et al., 1998), in misura inferiore all’interno della regione codificante (CDS) (Mohr, 1999; Chiaruttini et al., 2009) e dei 5’UTR (Muslimov et al., 1997). Tra le più comuni RBPs annoveriamo CPEB, ZBP, hnRNP, Staufen, FMRP, Translin e le proteine ELAV. Ricordiamo come molte di queste proteine di trasporto degli mRNA siano in realtà repressori della traduzione, al fine di prevenirne l’espressione ectopica durante il trasporto. Le RBPs che si legano all’mRNA di BDNF non sono ancora note, tuttavia nel corso di questo studio, mediante ibridazioni in situ non radioattiva su colture ippocampali/sezioni di cervello di topo è stata scoperta un serie di elementi in cis che regolano la localizzazione del trascritto. Alla luce dei risultati ottenuti, emerge un complesso quadro di regolazione post-trascrizionale e traduzionale di BDNF. L’RNA endogeno si localizza nel compartimento dendritico distale in seguito ad attività elettrica ed applicazione di BDNF od NT-3. I segnali di trasporto sensibili sono molteplici e distribuiti in diverse regioni dell’mRNA: un segnale costitutivo a carico della CDS(riconosciuto da translin), due segnali inducibili a livello del 3’UTR short (KCL ed NT-3, riconosciuti da CPEB1 e 2, ELAV2 e 4) ed altrettanti a livello 3’UTR long (KCl e BDNF, target di ELAV e CPEB), in aggiunta ad un segnale di ritenzione all’interno della stessa regione (osservato anche in topi KO per FXR2 ed FMRP). La modulazione del trasporto del 3’UTR long è di gran lunga più finemente regolata rispetto alla variante short, e ricorda il comportamento del 3’UTR della CaMKII (Mori et al., 2000), anch’esso coinvolto nella plasticità e potenziamento sinaptici. Dal punto di vista traduzionale, la distinzione tra 3’UTR short e long è netta: per quanto riguarda il primo, il meccanismo è piuttosto lineare e viene attivato dalla cascata del glutammato/Aurora chinasi/CPEB, mentre per il secondo, scarsamente traducibile, sembra sia necessaria la compresenza di più stimoli per attivarne la corretta traduzione, suggerendo come il 3’UTR long possa rappresentare un “coincidence detector“ che viene attivato solo in particolari contesti, a traccia di una complessa attività sinaptica. Dagli studi condotti siamo stati in grado di costruire un modello che possa spiegare come un trascritto così complesso possa rispondere a diversi stimoli. La CDS contiene un segnale di trasporto costitutivo mediato da translin, che in condizioni basali viene soppresso da un elemento inibitorio all’interno del 3’UTR long. In seguito ad attivazione viene meno la repressione in modo da favorire il trasporto del trascritto mediato dai due segnali di targeting (CDS e 3’long). Per quanto riguarda i trascritti contenenti la variante short, invece, sembra non vi siano segnali di ritenzione, bensì elementi di trasporto che vengono attivati in seguito ad uno specifico stimolo extracellulare (KCL od NT3).1388 553 - PublicationANSwER-Sistema informativo ambientale basato su ontologia e logica Fuzzy(Università degli studi di Trieste, 2008-04-15)
;Licheri, Davide ;Altobelli, AlfredoSponza, StefanoLe fonti dati rilevanti per il monitoraggio dell’avifauna delle lagune friulane, previsto dal progetto ANSER (Programma INTERREG IIIA Transfrontaliero Adriatico), sono alimentate da tre diverse metodologie di censimento, una metodologia di cattura/marcatura e una metodologia di tracciamento radio telemetrico. L’ampio spettro di informazioni a riguardo è confluito in un sistema informativo ambientale che 1) traduce tutti i dati in Ecological Metadata Language (EML) seguendo un unico modello sintattico orientato agli oggetti, 2) lo arricchisce semanticamente con una ontologia di dominio basata sulla Logica Descrittiva, 3) ne analizza le performance predittive, validando, attraverso un sistema inferenziale fuzzy, il modello teorico rispetto ai dati raccolti su campo. I risultati più importanti sono descrivibili così: 1) l’eliminazione completa di eterogeneità tra dataset ha permesso di atomizzare le tuple, reificando in un’unica super-classe di eventi nel tempo, i contatti tra operatore e animale in un determinato luogo; 2) l’ontologia OWL-DL ha determinato in maniera consistente l’appartenenza delle specie alle guild considerate e la relativa attrazione verso i diversi habitat disponibili; 3) il modello fuzzy ha rivelato che le informazioni sull’habitat e sulla profondità delle acque nel punto di monitoraggio, influiscono differentemente sulla predizione di abbondanza delle diverse guild esaminate.1257 3677 - PublicationApplicazioni della glicobiologia all'imaging molecolare(Università degli studi di Trieste, 2009-03-02)
;Flamigni, Anna ;Paoletti, SergioCoslovi, AnnaI carboidrati sono stati per molto tempo considerati molecole aventi solo funzioni di tipo strutturale e di riserva energetica per la cellula e non sembravano in alcun modo coinvolti nei processi che contribuiscono allo sviluppo di una cellula completamente funzionante. Nuove ed accurate ricerche hanno dimostrato il ruolo svolto dai carboidrati in numerosi processi biologici al punto che attualmente essi sono considerati la terza categoria di macromolecole con caratteristiche bio-informative. I carboidrati sono strutture che possono dare una quantità di informazioni estremamente elevata; l’innumerevole variabilità dei legami con cui le unità monosaccaridiche possono costituire strutture più complesse, permette ai carboidrati di utilizzare un linguaggio estremamente eloquente. Questo linguaggio ha preso il nome di Glicocodice. I decifratori del glicocodice sono tipicamente proteine leganti gli zuccheri chiamate lectine, caratterizzate da un’elevata specificità; lectine in grado di riconoscere in modo specifico unità beta-galattosidiche, chiamate galectine, risultano coinvolte in numerosi processi che regolano l’omeostasi cellulare, tra cui le interazioni cellula-cellula, cellula-matrice, ma anche i sistemi apoptotici ed il differenziamento cellulare. Inoltre esse risultano strettamente correlate con lo sviluppo di numerose patologie tra cui i tumori e le infiammazioni articolari come l’osteartrite e l’artrite reumatoide. In particolare, la galectina-1, molecola regolatrice pro-apoptotica, risulta sovraespressa nei pazienti affetti da artrite reumatoide. Al contrario, l’aumentata espressione della galectina-3 risulta essere un fattore rilevante per lo sviluppo di patologie osteoartritiche. Le convenzionali metodologie di indagine diagnostica per immagine sono purtroppo strumenti deboli per l’analisi di patologie croniche, in particolare risulta difficile la distinzione tra stadio acuto e cronico e l’identificazione di fasi iperacute. E’ per questo motivo che è così complessa la distinzione tra l’artrite reumatoide e le altre patologie osteoarticolari nelle prime fasi della malattia. La messa a punto di metodologie in grado di fornire una diagnosi precoce e precisa è dunque uno dei passi fondamentali nella lotta all’artrite reumatoide. Oggi sono disponibili test di tipo immunologico a livello sierico e tecniche di imaging in grado di dare alcune informazioni importanti sulla natura e sul decorso della malattia. Tuttavia questi risultano essere strumenti ancora carenti per una diagnosi precoce della patologia. Nella moderna era della medicina molecolare, terapie geniche e terapie cellulari potranno essere studiate direttamente e indirettamente tramite l’uso dell’ imaging molecolare. L’utilizzo di tecniche di imaging funzionale e molecolare assieme a strumenti di immagine anatomica, può indubbiamente incrementare la specificità e la sensibilità della diagnosi. Le procedure di indagine molecolare dovrebbero essere dunque considerate importanti strumenti complementari alle tecniche di indagine per immagini utilizzate correntemente in clinica. Nuovi mezzi di contrasto per MRI in grado di interagire a livello molecolare potranno dunque incrementare il potenziale di questa tecnica. Inoltre, l’emergere di nuove tecniche di diagnostica per immagini che utilizzano metodi ottici (fluorescenza e bioluminescenza), che sono attualmente di comune utilizzo in modelli animali in fase pre-clinica, sono in corso di sviluppo per la loro applicazione anche sull’uomo. Il presente progetto di dottorato ha avuto come obiettivo la messa a punto di un sistema diagnostico per immagini che permetta di individuare precocemente e con alta specificità la presenza di patologie artritiche infiammatorie, in modo tale da diagnosticare la malattia artritica nei primi stadi del suo sviluppo, ma anche di discriminarne la tipologia e la prognosi, al fine di poter applicare una corretta e tempestiva strategia terapeutica. Per realizzare tale obiettivo, nel corso del dottorato di ricerca, sono state sviluppate strategie sintetiche di nuovi mezzi di contrasto in grado di individuare markers specifici della patologia artritica, successivamente utilizzati su modelli cellulari e animali. In particolare, come bersaglio per tali mezzi di contrasto sono state individuate le galectine. Per ottenere l’interazione con le galectine i nuovi mezzi di contrasto devono contenere sonde per la diagnostica per immagini coniugate con strutture opportunamente modificate con ramificazioni di galattosio, al fine di permettere il legame selettivo alle galectine ed indicarne la presenza. Il progetto è stato articolato in due parti: Parte A, Analisi delle Patologie Articolari a Livello Molecolare. In questa fase sono stati sintetizzati complessi polimerici che potrebbero aiutare la comprensione dello sviluppo delle patologie articolari a livello molecolare. In particolare è stata effettuata la clusterizzazione di unità galattosidiche, note sonde biologiche per le galectine. La scelta delle strategie sintetiche è stata effettuata a partire dalla conoscenza del biopolimero Chitlac, composto le cui caratteristiche chimico/fisiche erano già ben note nel nostro laboratorio e a cui sono state riconosciute capacità di influenzare la crescita dei condrociti. Per meglio comprendere le interazioni e gli effetti di tale polisaccaride con molecole biologiche e colture cellulari, sono stati effettuati studi a livello molecolare e in vitro. In primo luogo si è quindi determinata la costante di affinità del Chitlac per le galectine-1 e -3, successivamente sono stati condotti studi di internalizzazione del Chitlac da parte di cellule presentanti un elevato numero di recettori per il galattosio (cellule di epatocarcinoma) e di condrociti primari, oggetto principale della nostra ricerca. I risultati ottenuti, hanno permesso di stabilire che il polisaccaride viene internalizzato negli epatociti in misura maggiore e in condrociti, in misura inferiore. Ne è seguito uno studio sull’effetto che il Chiltac svolge sul ciclo cellulare di tali cellule. Il risultato ottenuto ci ha indotti a pensare che il Chitlac sia in grado di interferire con le strutture che regolano il ciclo cellulare presumibilmente interferendo proprio con le galectine, proteine che controllano a monte l’espressione di proteine regolatrici dei checkpoint del ciclo cellulare. Questi risultati potrebbero finanche suggerire l’utilizzo del Chitlac non solo come sonda diagnostica ma anche some possibile agente terapeutico. Parte B, Analisi delle Patologie Artritiche a Livello Tissutale. Unità galattosidiche sono state ancorate a sonde per MRI, tra cui il DTPAGd (Magnevist®) presente in commercio e comunemente utilizzato in clinica, al fine di ottenere sonde maggiormente selettive nei confronti di patologie presentanti alterazioni dell’espressione di lectine. Come atteso, l’aggiunta dei gruppi ossidrilici dello zucchero ha portato ad un aumento dell’indice di relassività rispetto alla sonda commerciale con conseguente miglioramento dell’immagine MRI ottenuta dopo l’iniezione endovenosa del complesso di gadolinio. Infine, il Chitlac è stato utilizzato per evidenziare patologie artritiche in modelli animali tramite l’utilizzo dell’imaging ottico. A tale scopo, il polimero è stato coniugato con la sonda fluorescente Cy5.5. Le iniezioni intra-articolari del polimero hanno evidenziato le sole articolazioni patologiche, mentre il Chitlac è stato rapidamente allontanato dalle articolazioni sane. Una prima prova per via endovenosa ha inoltre permesso di verificare la permanenza nell’articolazione del polimero che dunque appare non subire un significativo sequestro da parte del fegato, come poteva essere ipotizzabile dai risultati ottenuti in vitro. Dagli studi condotti nel corso del presente progetto di tesi, è possibile concludere che la clusterizzazione del galattosio induce un incremento dell’affinità nei confronti delle galectine-1 e -3. Inoltre il polimero Chitlac (chitosano lattosilato) si è dimostrato in grado di interagire a livello cellulare al punto da influenzare il ciclo cellulare. Ulteriori studi potrebbero permettere una migliore comprensione di tali eventi. Infine, la possibilità di studiare condrociti derivanti da tessuti di articolazioni patologiche potrebbe permettere di valutare se in tali condizioni l’alterazione dell’espressione delle galectine possa essere tale da aumentare l’internalizzazione del polimero nelle cellule malate ed i suoi effetti sul ciclo cellulare. Studi preliminari in vivo su modelli di animale artritici, hanno permesso di evidenziare la permanenza del Chitlac nella articolazioni degli animali patologici, diversamente dagli animali sani, suggerendo un potenziale uso del polisaccaride nella discriminazione delle due tipologie di articolazione, effetto non evidenziabile con l’utilizzo di due polisaccaridi di controllo (chitosano e destrano), cioè privi del sostituente galattosio.1754 16205 - PublicationUn approccio trascrittomico per delineare i meccanismi molecolari alla base della risposta del mitilo Mytilus galloprovincialis a patogeni e alla contaminazione da biotossine algali(Università degli studi di Trieste, 2012-04-19)
;Gerdol, MarcoPallavicini, AlbertoL’avvento delle tecniche di sequenziamento di nuova generazione ha reso recentemente disponibile l’opportunità di analizzare su scala genomica e trascrittomica organismi non modello, anche nel caso in cui virtualmente non sia disponibile alcuna informazione pregressa. Il mitilo mediterraneo Mytilus galloprovincialis è un organismo di grande importanza economica ed è considerato un utile bioindicatore, ma nonostante ciò fino a questo momento gli studi molecolari sono stati fortemente limitati proprio dalla limitata conoscenza genomica di questo importante bivalve. In questa tesi sono state utilizzate tecniche di sequenziamento di nuova generazione per analizzare la risposta del mitilo a biotossine algali paralitiche (PSP) su scala trascrittomica a livello della ghiandola digestiva. L’enorme mole di dati di sequenza ottenuti ha permesso di studiare in modo approfondito alcune famiglie di geni di grande importanza nella risposta immune del mitilo. In particolare sono state individuate e descritte l’ampia famiglia di lectine C1q-like, coinvolte nel riconoscimento dei patogeni, e due nuove famiglie di peptidi antimicrobici, le big defensine e le mitimacine.1334 2356 - PublicationAutoanticorpi nelle malattie neurologiche(Università degli studi di Trieste, 2012-03-20)
;Zulian, StefaniaTongiorgi, EnricoEsistono più di 50 diverse patologie neurologiche che hanno una confermata o sospetta eziologia autoimmune e che si stima colpiscano 75 milioni di persone nel mondo. Sebbene negli ultimi anni sia cresciuto l’interesse per i meccanismi immunopatologici anticorpo-mediati, le evidenze di un ruolo primario degli autoanticorpi nella patogenesi delle malattie autoimmuni del SNC sono ancora poche. La maggior parte di queste patologie è rara e per molte di esse non esiste un metodo di diagnosi in quanto l’antigene (o gli antigeni) bersaglio della risposta autoimmune sono sconosciuti. A tale scopo risulta fondamentale il supporto di un test diagnostico che aiuti ad identificare la presenza di tali anticorpi nel siero dei pazienti. Lo scopo del mio progetto di Dottorato è stato la messa a punto di un metodo di identificazione di anticorpi anti-neurali caratteristici di diverse patologie che utilizza l’immunoistochimica su sezioni di cervello di ratto. Questo metodo è stato quindi testato per la rilevazione di autoanticorpi antineurali in particolare in 4 gruppi di patologie neurologiche: le sindromi Paraneoplastiche, la Neuromielite Ottica, le Neuropatie periferiche e Sclerosi Laterale Amiotofica (SLA). La ricerca di questa tesi di dottorato si è sviluppata seguendo tre obbiettivi specifici: 1. Creare un metodo di controllo qualità per il saggio di analisi immunoistochimica TABA e valutare la sua validità diagnostica. 2. Sviluppare un test che permetta l’analisi della reattività dei sieri di pazienti che presentano neuropatie non ancora classificate perché ad antigene ignoto. 3. Testare con la metodica TABA di immunoistochimica semi-quantitativa su sezioni di cervello di ratto sieri di pazienti affetti da SLA al fine di individuare un disegno di marcatura specifico. Il metodo utilizzato riguarda lo screening di anticorpi anti sistema nervoso basato su un’analisi immunoistochimica (IHC) semi quantitativa (metodo TABA) su sezioni di cervello di ratto al fine di descrivere e quantificare la reattività contro particolari regioni del cervello (Boscolo et al. 2007) e di discriminare le specifiche marcature associate alle differenti neuropatologie. L’innovazione di questa ricerca è stato quello di creare un metodo di controllo qualità per il saggio di analisi immunoistochimica mediante l’ideazione di un protocollo standard che si avvale dell’utilizzo di un controllo positivo (siero a reattività nota), la cui stabilità viene monitorata nel tempo tramite l’utilizzo di un algoritmo statistico. E’ stato scelto all’interno della sieroteca presente in laboratorio, un siero fortemente positivo all’analisi TABA e sono state marcate 80 sezioni di cervello con questo anticorpo. E’ stata quindi eseguita la densitometrie su 3 aree cerebrali: il midollo allungato, il V° strato della corteccia e le cellule del Purkinjie. Quindi è stato possibile definire un intervallo di confidenza densitometrico per standardizzare l’uso dell’ IHC, da utlizzare come protocollo di controllo qualità. L’identificazione di un metodo di controllo qualità per l’analisi immunoistochimica rappresenta un grande passo avanti nella diagnostica di laboratorio in quanto permette la standardizazzione di un metodo da molti sottovalutato ma indispensabile nell’identificare la reattività di un siero verso antigeni ignoti, nel caso in cui i kit attualmente in uso non ne identifichino l’antigene. Infine, grazie al confronto tra la diagnosi basata sul metodo TABA e i kit diagnostici è stato possibile valutare i parametri qualitativi del metodo TABA in termini di predittività e specificità. La seconda parte di questo lavoro è focalizzata allo sviluppo di un test che permetta l’analisi della reattività dei sieri di pazienti che presentano neuropatie non ancora classificate perché ad antigene ignoto. Attualmente in commercio esistono kit diagnostici per l’individuazione degli antigeni target delle neuropatie periferiche, tuttavia il numero di neuropatie autoimmuni non identificate è ancora alto. Pertanto abbiamo deciso di sfruttare la tecnica dell’IHC su nervo sciatico di ratto per individuare la presenza di un’autoimmunità nel caso in cui i kit commerciali risultino negativi. Questo studio prevede l’analisi di 25 sieri di pazienti affetti da neuropatie e il successivo confronto tra i vari protocolli al fine di individuare un metodo per l’analisi immunoistochimica su nervo sciatico di ratto utilizzando anticorpi secondari specifici anti IgG ed IgM umane. E’ stato effettuato quindi uno studio in relazione ai diversi disegni di marcatura delle sezioni, al fine di trovare una correlazione tra la patologia e il pattern di marcatura (sugli assoni, sull’endonevrio ed un pattern misto). I risultati ottenuti con questo nuovo approccio “home made” sono stati in seguito paragonati con quelli riscontrati utilizzando un kit diagnostco commerciale Euroimmun Italia. Tuttavia, la metodica di IHC non è risultata in nessun caso idonea per la rilevazione di autoanticorpi IgG o IgM nelle neuropatie periferiche. Paralellamente è stato svolto uno studio riguardante un gruppo di pazienti afferri da sclerosi laterale amiotrofica (SLA), per cui vi sono evidenze di una possibile componente autoimmune (Pagani et al. 2006). Sono stati analizzati 14 sieri di pazienti con confermata diagnosi di SLA e 9 sono risultati positivi all’esame immunoistochmico TABA per le IgG di cui 2 erano positivi kit per autoanticorpi paraneoplastici. Pertanto in 7 pazienti, si è riscontrata una reazione anti-neurale non spiegata da anticorpi noti. E’ stato possibile inoltre identificare un pattern di marcatura comune nei sieri affetti da SLA che corrisponde ad una marcatura del nucleolo (Parker et al. 2009). Quattro di questi sieri sono risultati positivi per l’antigene Ro52 con il metodo line blot. Questi risultati supportano l’ipotesi autoimmune nella SLA e confermano l’uso della IHC con il metodo TABA come con importante strumento di diagnosi e di ricerca di nuovi autoanticorpi.4257 17913 - PublicationAVV-mediated delivery of Semaphorin 3A influences tumor miscroenvironment and inhibits tumorigenesis in vivo(Università degli studi di Trieste, 2009-04-21)
;Carrer, Alessandro ;Giacca, MauroZacchigna, SerenaLe semaforine di classe 3 costituiscono una piccola famiglia di proteine che sono state inizialmente studiate per la loro capacità di dirigere la crescita del cono assonico durante lo sviluppo. Tuttavia, tali molecole sono state recentemente coinvolte in ulteriori processi biologici, tra cui merita particolare attenzione il processo angiogenetico, in cui diverse semaforine sembrano partecipare attivamente anche se con ruoli e funzioni variegati. Tale eterogeneità funzionale ha spesso dato origine a risultati apparentemente contraddittori, dovuti per lo più alla scarsa conoscenza del reale coinvolgimento delle diverse semaforine nell’angiogenesi. Questo studio è stato incentrato sul ruolo della semaforina-3A (Sema3A), analizzando nel dettaglio i mutamenti apportati al microambiente locale da una sua overespressione in vivo. Questa proprietà non è stata finora riportata in letteratura e si esplica principalmente attraverso il reclutamento di cellule mononucleate di derivazione midollare. Ciò è stato inizialmente osservato nel muscolo scheletrico di topi wild-type a seguito di trasferimento genico della Sema3A mediate tecnologia AAV. Sia a 15 giorni che a un mese dopo l’iniezione del vettore virale è stato possibile osservare la presenza di un imponente numero di cellule mononucleate che infiltravano le fibre muscolari. Attraverso analoghi esperimenti mediante vettori AAV, il nostro laboratorio aveva precedentemente dimostrato un simile richiamo di cellule a seguito di espressione di VEGF165, un potente fattore pro-angiogenetico (Arsic et al, Mol. Ther., 2003). Viceversa, molte indicazioni suggerivano che Sema3A fosse in realtà un fattore anti-angiogenetico, come successivamente è stato appurato (Acevedo et al, Blood, 2008 & Zacchigna et al, J.Clin.Invest., 2008). Era perciò ragionevole pensare che i due fattori (VEGF165 e Sema3A) reclutassero in situ due popolazioni cellulari differenti, in grado di accompagnare attività biologiche contrapposte. Diversi approcci sperimentali, tuttavia, ci hanno condotto a sostenere l’ipotesi che entrambe le molecole in realtà richiamino la medesima sub-popolazione mieloide agendo attraverso l’attivazione di neuropilina-1 (Nrp-1), un recettore in grado di legare sia VEGF165 che Sema3A. Da notare che VEGF121, un’isoforma del gene VEGF carente dell’esone 7, quando overespressa nel muscolo scheletrico non causa il reclutamento di cellule infiltranti, coerentemente con la sua incapacità di legare Nrp-1. Oltre a ciò, l’espressione ectopica di VEGF121, contrariamente a quanto accade per VEGF165, non determina la formazione di arteriole (vasi di media grandezza, ricoperti da cellule della parete vascolare come periciti e cellule muscolari lisce), pur causando un eguale aumento del letto vascolare attraverso iper-proliferazione capillare. Ciò ci ha indotto a pensare che la presenza di cellule richiamate attraverso Nrp-1 (chiamate da noi NEM) sia in realtà indispensabile per la maturazione dei vasi neo-formati. In effetti, la co-iniezione di AAV-VEGF121 e NEM ci ha permesso di osservare a 15 giorni un fenotipo chiaramente arteriogenico (presenza di vasi α-SMA+), contrariamente al fenotipo esclusivamente capillogenico determinato dalla sola iniezione di AAV-VEGF121. Attraverso una caratterizzazione estensiva delle cellule richiamate da VEGF165 o Sema3A, abbiamo potuto riconoscere i NEM come una popolazione mieloide precedentemente mai descritta e differente da altre popolazioni midollari coinvolte nell’angiogenesi. In aggiunta, attraverso l’analisi della loro espressione genica abbiamo potuto riconoscere alcuni geni tipicamente espressi da macrofagi polarizzati in senso M1, noti per essere pro-infiammatori e anti-tumorigenici. I NEM sono stati inoltre visti esprimere alti livelli di PDGFβ e TGFβ, due molecole coinvolte nella maturazione vascolare. Il fenotipo M1-like e la capacità di indurre la maturazione della vascolatura sono entrambe caratteristiche potenzialmente in grado di influire negativamente sulla crescita tumorale. Abbiamo quindi deciso di investigare più nel dettaglio come il reclutamento di questo particolare tipo cellulare influisse su un modello tumorale ottenuto tramite xenotrapianto di cellule singeniche direttamente nel muscolo scheletrico. Muscolo precedentemente condizionato mediante trasferimento genico di VEGF165, VEGF121 o Sema3A. In linea con l’ipotesi da dimostrare, la precedente espressione di VEGF165 o Sema3A rende meno efficace l’attecchimento del tumore, rallentandone la crescita, mentre il trasferimento del gene codificante per VEGF121 addirittura accelera tale crescita, come d’altra parte prevedibile per un fattore angiogenetico. Una dettagliata analisi morfologica della rete vascolare tumorale ci ha permesso di constatare come il richiamo di NEM mediante pre-condizionamento da Sema3A causasse una più matura struttura vascolare (in termini di mural cell coverage, di dimensioni e di tortuosità dei vasi). Per avvalorare definitivamente il ruolo dei NEM nell’inibizione tumorale osservata dopo trasferimento genico, abbiamo purificato tali cellule direttamente da muscoli scheletrici di topi precedentemente iniettati con AAV-Sema3A. Tali cellule sono poi state amministrate direttamente in masse tumorali in crescita in topi singenici. Esse sono risultate effettive nel rallentare la crescita tumorale in fasi tardive, consistentemente con una loro capacità di sostenere la maturazione della vascolatura tumorale. Un’analisi più approfondita di ha permesso di rilevare diversi segni di una “normalizzazione” vascolare a seguito della somministrazione dei NEM, essendo i vasi più maturi, meno dilatati, meno tortuosi e, dato importante, meno permeabili.1214 2010 - PublicationBDNF translational control as a therapeutic target in Rett syndorme(Università degli studi di Trieste, 2011-04-11)
;Vaghi, ValentinaTongiorgi, EnricoRett syndrome (RTT, MIM 312750) is a debilitating neurodevelopmental disorder that manifests in early childhood and affects almost exclusively girls. It 's a genetic disorder and is present worldwide with an estimated average incidence of 1:10,000 / 15,000 newborn girls. RTT is the second leading cause of mental retardation in female often misdiagnosed as autism or an unspecified developmental delay. In its classic version, this disease is caused by mutations in the transcription factor Methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2) located on the female X chromosome (Amir et al., 1999). MeCP2 is a transcriptional regulator of many genes, including the neurotrophic factor Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF). BDNF is a member of the neurotrophins family and represents a key molecule for neuronal survival and development, and it is involved in learning and memory processes. BDNF levels significantly increase during the first period of postnatal life till it reaches the threshold necessary for the maturations of neurons with the development of dendrites, axons, dendritic spines and synapses. Recent studies have shown that in transgenic mice, in which MECP2 gene has been inactivated to mimic the symptoms of RTT, the mRNA levels of BDNF are reduced and, in these animals at 6-8 weeks of age, the total content of BDNF protein is reduced by 70%. Furthermore, the overexpression of BDNF in MeCP2-/Y mice leads to an increase in lifespan, improved locomotor deficits and electrophysiological defects, while the deletion of the gene coding for BDNF in the same animals leads to an early onset of the disease symptoms. The main goal of this thesis is to identify a possible drug treatment for the treatment of RTT. The idea is based on the fact that in animal models of RTT there are residual levels of mRNA coding for BDNF and that many drugs, mostly used for the treatment of depression, are able to increase the synthesis of BDNF. In this study we analyzed the residual expression of different BDNF transcripts in human brain and in two models of RTT (the mouse and the cellular model). Using quantitative PCR, we determined the residual expression of BDNF transcripts in post mortem brain samples of RTT patients, using tissues from somatosensory and motor cortex (Broadmann areas 1-5), which are the most affected by the disease. In addition, we determined the expression of BDNF transcripts in the cortex and hippocampus of MeCP2-/Y at different of post-natal ages. Finally, in order to establish a cellular model of disease, we disrupted the expression of MeCP2 gene in human neuroblastoma cell line SHSY-5Y (via RNA interference), and then we measured the expression levels of BDNF transcripts. Using the same cell line we obtained information on the translatability of the different BDNF transcripts through a luminescence assay, based on firefly luciferase as a reporter gene. We observed that in the absence of stimuli, each exon contained the 5'UTR of the BDNF leads to a different level of translation of the reporter gene. We therefore conducted a systematic pharmacological translation of each BDNF transcript to determine what compounds may be used to stimulate the synthesis of BDNF starting from its own specific transcripts. The treatment with serotonin and norepinephrine separately, or with two antidepressants such as desipramine and mirtazapine were found to be most effective in stimulating the BDNF synthesis. These results encourage the planning of future experiments to test the efficacy of existing antidepressant drugs in restoring the compromised BDNF levels in RTT.1497 2034 - PublicationBenthic ecosystem functioning in coastal and shallow environments(Università degli studi di Trieste, 2013-03-25)
;Franzo, Annalisa ;Cibic, TamaraDel Negro, PaolaMolte attività antropiche sono localizzate lungo le coste e poggiano sui molteplici servizi offerti da questi particolari ecosistemi. Con l’aumentare della vulnerabilità e del sempre più accentuato stato di degrado di queste aree, diverse politiche ambientali sono state sviluppate con lo scopo di promuovere una gestione sostenibile delle risorse naturali, tra cui la Direttiva Quadro sulla Strategia per l’Ambiente Marino (2008/56/EC) in Europa. Le realtà economiche e sociali sono strettamente connesse tra loro e con i sistemi ecologici su cui poggiano. Per comprendere come l’uomo interagisce con l’ambiente, il modello concettuale DPSIR viene ampiamente adottato. Inoltre, sul piano strettamente ecologico, una solida conoscenza del funzionamento dell’ecosistema costiero costituisce un prerequisito fondamentale. Questa tematica complessa deriva dall’integrazione di parametri sia strutturali (caratterizzazione chimica e delle comunità biologiche) che funzionali (quali i principali processi di produzione primaria, respirazione e degradazione della sostanza organica), che nell’insieme descrivono come le varie forme di carbonio sono stoccate e come si realizza il fluire di carbonio ed energia attraverso il sistema. Lo studio del funzionamento dell’ecosistema bentonico costituisce uno strumento particolarmente utile nello sviluppare forme sostenibili di gestione ambientale dal momento che il dominio bentonico funge da deposito di ciò che avviene nella colonna d’acqua. I casi di studio presentati descrivono la parte PSI del modello concettuale DPSIR: come le Pressioni inducono cambiamenti nello Stato dell’ecosistema determinando di conseguenza alterazioni ambientali ed eventuali influenze negative sulle attività umane (Impatti). Lo scopo della tesi consiste nel contribuire a promuovere una gestione basata sull’ecosistema e sul suo funzionamento in aree costiere mediante una miglior conoscenza della sua funzionalità in presenza di specifici stress. I casi di studio vengono presentati secondo un ordine dettato dell’aumentare della complessità dell’approccio seguito: dal più semplice, caratterizzato solo da parametri strutturali, al più complesso, in cui sono stati indagati anche diversi parametri funzionali. La risposta della comunità microalgale bentonica (microfitobenthos - MPB) alle biodeposizioni derivanti dalle mitilicolture è stata studiata non solo paragonando una mitilicoltura con un controllo ma anche considerando le caratteristiche della comunità sotto ad un impianto più recente e in un’area dove l’attività è stata rimossa (Capitolo 2). Questo approccio innovativo permette di indagare l’evoluzione temporale dell’impatto e se è possibile un ripristino. Comparando le quattro aree, la comunità è caratterizzata da una maggiore proliferazione dei taxa tolleranti a condizioni di arricchimento organico sotto alle mitilicolture attive rispetto agli altri due siti. L’area dismessa, inoltre, presenta un popolamento microalgale simile a quello del controllo suggerendo la resilienza del sistema e, di conseguenza, una certa sostenibilità dell’attività di mitilicoltura. Tre comunità bentoniche sono state studiate sinotticamente in un’area costiera soggetta a stress multipli, come l’influenza del Po, la presenza di piattaforme per l’estrazione del gas e il prelievo/scarico di sedimenti (Capitolo3). Insieme alla caratterizzazione chimica, lo studio del MPB, della meiofauna e della macrofauna forniscono una descrizione dello stato dell’ecosistema bentonico in un esempio di monitoraggio che costituisce una base di dati a cui fare riferimento prima di qualsiasi intervento nell’area d’interesse. Lo studio di mesocosmo (Capitolo 4) è focalizzato sulla risposta della comunità microbica bentonica ad un abbassamento di pH dovuto alla fuoriuscita di CO2 da un suo sito di stoccaggio CCS (Carbon dioxide Capture and Storage). Costituisce un esempio di esperimento condotto in laboratorio con lo scopo di simulare eventuali scenari futuri derivanti da un intervento antropico in ambiente naturale prima della sua realizzazione. Relativamente a questo focus, sia i parametri strutturali (abbondanze picobentoniche, densità e composizione del MPB) che i funzionali relativi alla comunità microbica bentonica (attività enzimatiche, Produzione Procariotica di C e respirazione) sono stati studiati per la prima volta. I risultati suggeriscono che la comunità microbica è scarsamente sensibile anche ad un considerevole abbassamento di pH, probabilmente a causa di un effetto buffer esercitato dalla matrice sedimentaria. L’azione sinergica di idrocarburi e metalli pesanti sul funzionamento dell’ecosistema bentonico è stata studiata in un sistema fluviale-lagunare severamente contaminato (Capitolo 5). Numerosi parametri sono stati considerati e dalla loro integrazione deriva un’accurata descrizione del fluire di carbonio attraverso il sistema. I risultati relativi ai parametri microbici come le attività degradative, le produzioni primaria e secondaria e l’analisi del MPB, delineano una situazione inaspettata nel sito considerato più impattato. Il sedimento di tale stazione ospita infatti una comunità microbica bentonica estremamente attiva sia in termini di produttori primari che di procarioti volti al recupero della sostanza organica e conseguente conversione in nuova biomassa. Gli studi presentati in questa tesi non hanno la pretesa di costituire una descrizione esaustiva e completa del funzionamento dell’ecosistema bentonico, ma sottolineano l’importanza di questo approccio innovativo nel contribuire a sviluppare forme sostenibili di gestione delle risorse costiere.1075 1114 - PublicationBIOMARKERS TO DEFINE OPTIMAL PROTEIN REQUIREMENT(Università degli studi di Trieste, 2015-04-28)
;Di Girolamo, Filippo GiorgioBiolo, GianniDietary proteins are the source of the amino acids required by the body for tissue growth and maintenance. The Population Reference Intake (PRI) for proteins, as defined by the European Food Safety Authority (EFSA) for healthy adults, including the elderly, is 0.83 g/kg body weight/day. This amount is defined on the net balance of body protein (or “nitrogen balance”, given by the difference between dietary nitrogen intake and losses) equivalent to 0.66 g/kg/day plus a safety factor for interpersonal variability and differences in proteins quality of mixed diets. The PRI, however, is the minimum daily amount of protein needed to maintain the nitrogen balance and avoid a progressive loss of lean body mass in healthy people with moderate physical activity. Therefore nitrogen balance may not be adequate to define protein requirement in adults and especially in ageing characterized by loss of muscle mass and function (sarcopenia). Furthermore until recently the prevalent idea was that a protein intake above PRI had no further benefits and on the contrary could impair health. These believes are now under discussion, diets with higher protein intake have been shown beneficial in the prevention and treatment of conditions such as sarcopenia, COPD and type 2 diabetes mellitus. There is a need of more precise methods to define protein requirement. AIM. The aim of the present thesis is to investigate in human healthy volunteers new biomarkers adequate to define optimal protein intake. Recent studies have determined protein needs by measuring whole-body protein metabolism using stable labeled isotope-amino acids. METHODS. Our research group has applied two different metabolic methods based on the most widely used tracer, i.e. D5-Phe stable isotope, in two experimental bed rest campaigns (FP7 PLANHAB and INTERREG PANGaA) in healthy volunteers. BR is a suitable model to investigate physiologic adaptation to inactivity. MAIN RESUTLTS. FP7 PLANHAB. We applied the stable isotope infusion technique, to assess the effect of physical inactivity and/or hypoxic condition on whole body protein turnover as previously described in Biolo et al 2008. Chronic hypoxia has been associated with an overall reduction in protein synthesis and in total plasma and skeletal muscle protein content. During the PLANHAB study we investigated, through a crossover randomization, the net effects of 10 days normobaric hypoxia (4000 mt.), associated with either ambulatory conditions or BR, in 11 young (age 24±4 yr), healthy and normal weight male subjects maintained on eucaloric diets. Main results. Hypoxia in ambulatory conditions significantly decreased whole body protein turnover by reducing both protein synthesis (-8±2%) and protein degradation (-8±3%). Hypoxia during bed rest did not caused significant changes in protein metabolism. INTERREG PANGaA. The skeletal muscle loss in aging is caused mainly by the “anabolic resistance” i.e. the inadequate increase in the rate of protein synthesis in response to nutritional-metabolic stimuli, including exercise, protein and amino acid intake as well as insulin and insulin-like growth factor stimulation. As a consequence, the net protein balance becomes negative leading to sarcopenia. The effects of ageing on the anabolic resistance induced by inactivity are poorly investigated. During the PANGeA study we had the opportunity to perform the second documented experimental BR in in healthy elderly volunteers and the first comparing aged with young subjects. To evaluate the anabolic resistance associated with ageing and inactivity, we enrolled 7 young (23±1yr) and 8 elderly (59±1yr) normal weight individuals, in a 14-d experimental BR protocol. We replaced our previous infusion method with a new, simpler, safer and quicker technique, by which tracers are given orally instead of parenterally, the all procedure is completed in two hours, instead of 6, and only two blood draws versus 7 are sufficient. Main results. At baseline parameters of anabolic sensitivity were comparable between young and elderly individuals. The anabolic resistance significantly increased after BR in both groups (bed-rest effect p<0.01), with a statistically significant bed-rest×group interaction (p=0.01). Anabolic resistance increased significantly in elderly (18.5%±7.3%) more than in young (5.2%±9.4%) subjects. DISCUSSION. In the PLANHAB study, hypoxia in ambulatory conditions reduced by the same level both protein synthesis and catabolism, as measured by isotope infusions, suggesting an adaptive mechanism: the lower energy production and availability induced by hypoxia associated with ambulatory condition. These modifications could not have been revealed by the use of nitrogen balance method, showing the relevance of more sophisticated analysis. The direct evaluation of the muscle protein metabolism through an infusion of stable-labeled isotope tracer, considered the golden standard methodology, gave us, in the PLANHAB study, reliable results in the early protein metabolism changes during hypoxia and/or BR. This method however has the limit of being complex, onerous and invasive, therefore being unsuitable for clinical evaluation. In the PANGeA study we could confirm the presence of a reduced sensitivity to anabolic stimuli in the elderly population compared to the young men. The elderly subjects are therefore, more at risk to develop changes of protein metabolism induced by inactivity. The simpler, timesaving and less invasive method we have developed for the PANGeA study, on the other hand, could be applied to a wider ranges of experimental conditions and clinical settings.927 1066