Scienze chimiche

In questo studio di tesi sono stati sviluppati ed ottimizzati nuovi supporti rigidi per la sintesi in fase solida in collaborazione con l’azienda Resindion srl. (Mitsubishi Chemical Corporation). Tali supporti, denominati Synbeads, sono stati poi caratterizzati dal punto di vista chimico e fisico ed applicati alla sintesi peptidica in fase solida. La parte iniziale dello studio si è concentrata sulla messa a punto del processo di polimerizzazione in modo da ottenere dei polimeri Synbeads caratterizzati da un grado di porosità ottimale e da una omogenea distribuzione del diametro particellare. Questi due parametri infatti influiscono notevolmente sull’applicabilità dei polimeri per sintesi su fase solida: - il grado di porosità, nei polimeri rigidi e che quindi non rigonfiano in solvente, deve garantire un buon trasferimento di massa dei reagenti e nello stesso tempo assicurare una buona resistenza dei polimeri stessi allo stress meccanico - la distribuzione particellare deve essere compresa in un ben definito range di diametro, in modo da permettere l’utilizzo dei Synbeads anche in sistemi automatizzati, senza che vi siano presente né particelle fini che potrebbero intasare i filtri, né particelle di dimensioni troppo grandi che potrebbero rendere difficoltoso il trasferimento delle stesse nei sistemi automatici. La successiva fase di ottimizzazione dei Synbeads si è concentrata su altri due parametri molto importanti, ossia la lunghezza dello spaziatore tra la matrice polimerica e il gruppo funzionale e la densità di gruppi funzionali presenti sui polimeri: - una distanza ottimale del gruppo funzionale dalla matrice del polimero ne garantisce la completa accessibilità chimica, evitando problematiche legate all’ingombro sterico - la densità di gruppi funzionali deve assicurare sia una buona capacità di carico (mmoli di gruppi funzionali per gdry di polimero) sia una completa accessibilità chimica di tutti i gruppi funzionali presenti sul polimero. In seguito a questo studio di ottimizzazione sono stati preparati i Synbeads con gruppo funzionale amminico (Synbeads A310). Partendo quindi dalle caratteristiche chimico-fisiche ottimizzate per la produzione dei Synbeads A310, sono stai messi a punto dei protocolli per la preparazione e la caratterizzazione dei altri Synbeads recanti gruppi funzionali diversi, ossia clorometilenici, bromometilenic, carbossilici ed idrossilici. Successivamente, i Synbeads A310 sono stati funzionalizzati con diversi linker che ne permettano applicazioni diverse nella sintesi in fase solida. Infatti, i Synbeads recanti i linker sono stati utilizzati per la preparazione da diversi Fmoc-AA-Wang-Synbeads e per la sintesi di un pentapeptide. Questo pentapeptide costituisce la sequenza dei primi cinque aminoacidi del Fuzeon®, un peptide che presenta attività inibitoria nei confronti dell’HIV. L’applicazione dei Synbeads è stata studiata anche per quanto riguarda il loro possibile utilizzo nella sintesi peptidica automatizzata con l’impiego di microonde, in particolare nel sistema Liberty CEM®. Grazie alle caratteristiche chimico-fisiche dei Synbeads e alla messa a punto di protocolli sintetici adatti a questi polimeri rigidi, si è potuto ottenere il prodotto desiderato con buone rese e un elevato grado di purezza. Nella parte finale di questo studio di tesi è stata indagata la distribuzione dei gruppi funzionali all’interno della matrice dei Synbeads. Combinando la tecnica ATR-FT IR con luce convenzionale e con luce di sincrotrone è possibile seguire la diffusione dei reagenti all’interno della matrice polimerica e verificare l’omogeneità della matrice stessa. Dopo aver messo a punto questa metodologia analitica, che permette un’indagine approfondita di ciò che avviene all’interno della matrice dei polimeri rigidi non trasparenti, un altro approccio analitico è stato sviluppato. Al fine di poter verificare in modo più rapido l’omogeneità della matrice polimerica, sezioni di Synbeads funzionalizzati con diverse concentrazioni di fluoresceina sono stati analizzati, permettendo in tal modo di verificare anche la distribuzione dei gruppi funzionali. Questo studio di dottorato quindi ha permesso di ottenere una nuova classe di polimeri rigidi per la sintesi su fase solida, i Synbeads, che hanno dimostrato di permettere l’ottenimento di ottimi risultati sia nella sintesi classica che in quella assistita da microonde. Nuovi approcci analitici sono stati studiati e applicati per verificare l’omogeneità della matrice polimerica e seguire i fenomeni di diffusione all’interno della matrice stessa. In tal modo, i Synbeads presentano un ottimo potenziale per un’applicazione su larga scala in processi industriali.

Nel corso di alcuni anni il nostro gruppo di ricerca, ispirandosi alla struttura dei composti naturali anfotericina B e squalamina, ha sintetizzato una serie di composti che incorporano gli elementi strutturali fondamentali di questi due ionofori naturali: un’unità idrofobica rigida, una catena idrofilica (modulo di conduzione) e uno o due gruppi terminali polari. L’attività di questi composti nel trasporto di ioni attraverso il doppio strato fosfolipidico è stata investigata utilizzando liposomi come modelli di membrana e metodologie basate sulla spettroscopia NMR e su tecniche spettrofluorimetriche mediante l’utilizzo di probe fluorescenti. Tra i composti sintetizzati, un analogo formato da un ottapeptide di Aib (acido α-amminoisobutirrico) Z-protetto all’ N-terminale (unità idrofobica) e legato tramite il C-terminale ad un gruppo amminico di una diammina derivata dall’esaetilenglicole (modulo di conduzione e gruppo terminale polare), ha mostrato di avere un’attività ionoforica molto elevata nei confronti del trasporto di cationi sodio. La comprensione del motivo di questa alta ed inaspettata attività è stata quindi uno degli scopi principali di questo lavoro di Tesi, in cui sono stati studiati analoghi con catena alchilica a lunghezza variabile al posto del gruppo Z, già precedentemente sintetizzati, per valutare l’effetto idrofobico del sostituente. Dopo aver raccolto una prima serie di dati, per comprendere la rilevanza della presenza dell’anello aromatico sullo ionoforo modello, è stata sintetizzata e studiata una serie di analoghi che portano un diverso gruppo aromatico al posto del gruppo Z. Il secondo e più generale scopo di questo lavoro di Tesi è stato l’inizio di uno studio sull’attività ionoforica di composti strutturalmente diversi al fine di razionalizzare le caratteristiche strutturali necessarie per ottenere composti attivi come trasportatori di ioni. A questo scopo è stata iniziata un’intensa collaborazione con diversi gruppi di ricerca che hanno sintetizzato una serie di possibili ionofori. Il gruppo del Prof. De Riccardis dell’Università di Salerno ha sintetizzato una serie di composti calixarenici sostituiti con catene spermidiniche e una serie di α-ciclopeptoidi formati da un numero variabile di N-benzilossietilglicine. Il gruppo della Prof. Montesarchio dell’Università di Napoli ha preparato degli oligosaccaridi ciclici, legati da legami fosfodiesterei a ponte, chiamati CyPLOS (Cyclic Phosphate-Linked OligoSaccharide macrocycles). Infine il gruppo del Prof. Casnati dell’Università di Parma ha sintetizzato una serie di calixareni sostituiti con un numero variabile di gruppi guanidinio. Tutti questi composti sono stati preparati allo scopo di poter effettuare un ampio studio concernente il rapporto struttura/attività e poter quindi definire i requisiti strutturali minimi per ottenere un composto con attività ionoforica. Accanto ai risultati ottenuti per ogni singola classe di composti, che sono illustrati e discussi in dettaglio nel terzo capitolo della Tesi, la possibilità di studiare un così ampio spettro di composti utilizzando le stesse condizioni sperimentali, ci ha permesso di ottenere delle considerazioni generali sulla natura dell’attività ionoforica ponendo le basi per la progettazione di nuove strutture che possano mostrare maggiore attività e/o selettività. Un altro importante risultato ottenuto durante questo lavoro di Tesi è stato l’acquisizione di esperienza nell’utilizzo di molte tecniche atte ad investigare l’attività ionoforica su liposomi come modelli di membrana. In particolare, è stato approfondita la conoscenza di tecniche comprendenti l’uso di probe fluorescenti che hanno mostrato di essere valide e di facile utilizzo per ottenere dati riguardanti vari aspetti dell’attività ionoforica come ad esempio le sequenze di selettività. Tuttavia, utilizzando esperimenti su liposomi, rimane molto difficile ottenere l’evidenza sperimentale della distinzione tra un meccanismo di trasporto tramite canale e altri tipi di meccanismi (es. carrier). Per questo motivo i dati ottenuti da questo tipo di esperimenti dovrebbero essere integrati da dati ottenuti per via elettrofisiologica e il nostro gruppo di ricerca si sta muovendo proprio in questa direzione.

Le problematiche ambientali relative alla potenziale presenza di composti organici clorurati, quali il tetraclorocarbonio, il cloroformio e il diclorometano, sono molto diffuse e di difficile risoluzione. Tali composti possono essere riscontrati in siti interessati, sia attualmente che nel passato, da attività di vario genere tra cui quella di produzione farmaceutica, alimentare e chimica. Sono in atto, oggigiorno, molteplici sperimentazioni finalizzate alla decontaminazione delle acque, siano esse di falda, di ruscellamento o di derivazione industriale, da tali composti. Una delle tecnologie che, negli ultimi anni, ha fornito risultati eccellenti per la decontaminazione di acque da varie tipologie di inquinanti tra cui quelli oggetto del presente lavoro, riguarda l’applicazione di barriere reattive permeabili. In particolare, gli studi riguardano la sperimentazione di materiali reattivi risultati efficaci anche per il trattamento di composti organici clorurati. La ricerca svolta si è concentrata sulla preparazione, sulla caratterizzazione e sulla sperimentazione di un materiale bimetallico reattivo a base di alluminio e rame per la decontaminazione di acque da tetraclorometano e da diclorometano. Le varie tipologie di bimetallo sono state realizzate utilizzando una soluzione di solfato di rame (uso agricolo) puro al 98.3 %, dell’idrossido di sodio in granuli e polveri di alluminio con un grado di purezza pari al 99.5% di cui sono state scelte cinque diverse classi granulometriche al fine di verificarne l’influenza sulle capacità reattive per il processo di decontaminazione. Sono stati prodotti 3 gruppi distinti di materiali Cu/Al in base sia alla quantità di polvere di alluminio utilizzata in fase di preparazione del materiale sia alla presenza o meno di processi di lavaggio del materiale post-formazione. La caratterizzazione del materiale è avvenuta attraverso analisi diffrattometriche e analisi in microscopia elettronica a scansione (SEM) che hanno permesso di individuarne la struttura e di identificarne le fasi cristalline che lo compongono. Le sperimentazioni per testare l’attività dei materiali sono state condotte in batch con acque contaminate da tetraclorometano o diclorometano a concentrazioni dell’ordine delle ppm ovvero superiori ai limiti imposti dalla Tab. 2 Allegato 5 (Tit.V) del DLgs 152/06 per le acque sotterranee. Le analisi chimiche, eseguite con un Purge and Trap interfacciato a un gascromatografo accoppiato ad uno spettrometro di massa, sono state realizzate presso i laboratori Hydrotech S.r.l. - Area Science Park, Padriciano, 99 - Trieste. La metodologia di analisi ha permesso di quantificare le percentuali di abbattimento di contaminante sia nel caso del tetraclorometano che del diclorometano e di verificare la formazione di prodotti secondari o di degradazione.

Al giorno d’oggi, il caffè rappresenta una delle principali materie prime commercializzate, la cui produzione mondiale si classifica seconda solo rispetto al petrolio e al primo posto in termini di materia prima alimentare. Essendo interamente prodotto nel Sud del mondo, il caffè costituisce la maggiore fonte di guadagno dei Paesi tropicali produttori, in cui viene denominato “oro verde”. Il motivo del suo successo mondiale come bevanda deriva dalla sensazione a livello gustativo e olfattivo che suscita in chiunque lo beva e dal suo ben noto effetto stimolante, attribuito principalmente alla caffeina. Per garantire un ottimo prodotto finale, ad esempio in Italia l’ Espresso, è necessario garantire e ricercare continuamente la qualità del caffè lungo tutta la sua catena di produzione: da “ciliegia” rossa a bevanda, questa materia prima percorre un lungo cammino in cui subisce molteplici e delicate trasformazioni. Il termine “qualità del caffè” assume quindi diversi significati a seconda del ruolo che ognuno può avere all’interno della catena di produzione. Per la illycaffè, nostro partner industriale, qualità significa bevanda di caffè costituita al 100% da Arabica, la specie di caffè più preziosa in commercio. La sua indiscussa qualità è dovuta principalmente alle sue caratteristiche organolettiche; infatti l’ Espresso derivante da Arabica è un caffè profumato, dolce, delicato e leggermente acido. Per questo motivo, è molto importante per illycaffè salvaguardarsi da possibili frodi o sofisticazioni, ovvero dalla contaminazione di Arabica da Robusta, l’altra specie (meno pregiata) di caffè presente in commercio. Per quanto riguarda la composizione chimica, la differenza fondamentale tra le due specie di caffè è la presenza, solo nella Robusta, del 16-O-methylcafestolo, diterpene contenuto nella porzione insaponificabile dell’olio di caffè. L’assenza di tale composto nell’ Arabica fa sì che esso sia un eccellente ‘molecular marker’ per l’identificazione di Robusta in una miscela di caffè, rilevandone così la mancanza di autenticità ove questa sia commercializzata come Arabica 100%. Questo progetto di tesi di dottorato nasce dall’interesse di sviluppare uno strumento capace di riconoscere il 16OMC in una miscela di caffè tostato, per esempio sfruttando biomolecole, come proteine e peptidi, che già naturalmente si comportano da recettori, o strutture molecolari progettate su misura con le caratteristiche per interagire selettivamente con i diterpeni. Questo sensore altamente specifico e selettivo per il 16OMC costituirebbe un kit d’analisi rapido ed efficiente in grado di proteggere la illycaffè da possibili frodi e adulterazioni. Per raggiungere questo obiettivo, per prima cosa è stata messa a punto una nuova metodica di estrazione e di purificazione dei diterpeni, principalmente cafestolo e 16OMC, da una miscela di caffè tostato Robusta 100%, perché si tratta di composti non facilmente reperibili sul mercato e molto costosi. I diterpeni estratti sono stati completamente caratterizzati, fornendo nuovi dati e/o confermando i dati già presenti in letteratura, talvolta incompleti. Inoltre questa metodica ci ha permesso di purificare e caratterizzare anche un altro componente della frazione insaponificabile del caffè: il β-sitosterolo, uno tra i più abbondanti steroli presenti nel caffè. Per lo sviluppo di un biosensore selettivo basato sull’interazione di una biomolecola con un composto target, sono stati considerati diversi approcci. Il primo approccio valutato è stato quello di partire da una proteina naturale, ben organizzata e stabile, e ridurre le sue dimensioni fino all’ottenimento di un peptide che risulti stabile e mantenga la funzionalità del sito attivo. In tale prospettiva è stata studiata tramite spettroscopia di fluorescenza l’interazione tra diterpeni e albumina umana (HSA), albumina umana priva di acidi grassi (ff-HSA), albumina bovina (BSA) e il recettore nucleare FXR (Farnesoid X Receptor). Gli esperimenti sono stati fatti in condizioni fisiologiche. Per quanto riguarda le albumine, si è osservato che i siti coinvolti nell’interazione con i diterpeni sono il sito denominato Sudlow site I, in cui è presente il Trp, causando una alterazione della fluorescenza, e il sito degli acidi grassi, contiguo al sito I, andando a modificare drasticamente la conformazione della proteina. Un’analisi degli spettri di dicroismo circolare registrati in presenza di sola albumina e successivamente aggiungendo diterpeni hanno confermato questo cambio conformazionale. Cafestolo e 16OMC presentano affinità per le albumine simili a quelle di altre piccole molecole capaci di legarsi ad esse. Tuttavia i dati ottenuti sono stati utili da un punto di vista fisiologico. L’interazione tra cafestolo e FXR, recettore coinvolto nell’omeostasi del colesterolo, è stata studiata per ottenere informazioni sull’attività biologica e per valutare il recettore come un potenziale strumento per la progettazione di biosensori. FXR è in grado di legare il cafestolo con una affinità molto elevata. La costante di dissociazione ottenuta (KD), 50 nM, è molto promettente. E’ da considerarsi, tuttavia, come un dato preliminare e studi che confermano questa ipotesi sono ancora in corso. Un ultimo approccio ha riguardato la modifica strutturale dei diterpeni. L’idea è quella di legare dei linkers all’anello furanico dei due diterpeni in modo da lasciare liberi il diolo del cafestolo e l’etere del 16OMC, poiché sono i gruppi funzionali che vogliamo discriminare. Il legame con il linker permette di immobilizzare i diterpeni modificati a supporti solidi, come chip d’oro, e di eseguire rapidamente screening di librerie peptidiche e selezionare i peptidi più promettenti tra i tanti componenti di una libreria. Per questo scopo, dopo protezione degli ossidrili di cafestolo (tramite acetonide) e 16OMC (formazione di etere), è stata eseguita l’alchilazione del furano. Tale via è ancora in fase di sviluppo.

Coffee is a worldwide diffused beverage and it has a very high impact on the global economy. The success of coffee is due to the perfect combination between the overall involvement of our senses and the well-known stimulating effect. During the years, many studies focused on its volatile fraction, but our knowledge about the taste responsible compounds is still nowadays scarce. Among such compounds present in the coffee beans, chlorogenic acids (CGAs), that belong to the polyphenols family, acquire more and more importance, due to their key-role in determining the coffee flavor, particularly its bitterness, their beneficial health properties, and their possible use as marker to control the industrial process. The roasting of green coffee beans causes a partial loss of CGAs due to the formation of degradation products, such as the corresponding lactones, whose amount depends on the roasting degree; the identification and the quantification of acids and lactones in coffee could be therefore a useful parameter to evaluate the final quality of the beverage. This PhD project arises from the interest in searching new methodologies for the selective analysis of the lactone fraction, exploiting the recognition properties of biomolecules, proteins or peptides, or of designed sensing elements with high affinity for such lactonic compounds. The chosen molecules, not commercially available, were first synthesized and fully characterized, namely: 3,4-O-dicaffeoyl-1,5-gamma-quinide, 3-O-[3,4-(dimethoxy)cinnamoyl]-1,5-gamma-quinide, 3,4-O-bis[3,4-(dimethoxy)cinnamoyl]-1,5-gamma-quinide, and 1,3,4-O-tris[3,4-(dimethoxy)cinnamoyl]-1,5-gamma-quinide. A direct synthesis of the tri-substituted quinide was also tuned up, starting from D-(-)-quinic acid and 3,4-dimethoxycinnamoyl chloride. Considering the potential biological activities of polyphenols, the antiviral properties of these compounds against many viruses have been also evaluated. A possible approach to develop a selective biosensor is to use natural peptide scaffolds, with stable and highly organized conformations, and reduce its dimensions down to the limit of receptor stability, exploiting even the randomization of the aminoacid within the binding site to improve its ligand properties. In this perspective, the specific binding constants to Human Serum Albumin (HSA), more exactly to its Sudlow site I, of caffeic acid, ferulic acid, 3,4-dimethoxycinnamic acid, 5-O-caffeoyl quinic acid and of the four synthesized quinides were measured in physiological conditions by fluorescence spectroscopy, reaching promising KD values, in the micromolar range; moreover 3,4-O-dicaffeoyl-1,5-gamma-quinide gave a peculiar result, showing a very interesting double binding in the same active site of the protein. The two diester quinides were also used to test, always by means of fluorescence spectroscopy, the binding ability of a functional 100 aminoacids fragment that replicates the binding site I of the whole protein: this peptide, called HSA100, has been obtained by our research group; even some mutants of HSA100 have been prepared and four of them, randomly chosen, were used in the fluorescence assays. The obtained binding constants with HSA100 and its four mutants remain in the micromolar range, close to those measured with the whole protein, suggesting that proper mutations could lead to a selective biosensor with high affinity for the quinides. The Surface Plasmon Resonance (SPR) technique could offer a way for the fast screening of the binding properties. In the perspective of setting up a SPR method to quickly select the hits of the mutants libraries, a linker-equipped quinide was synthesized and immobilized on a gold chip, then the binding with HSA was tested in this way. Considering the well-known interaction between polyphenols compounds, such as chlorogenic acid, and caffeine in aqueous solution, NMR titrations were performed to study the behavior of caffeine with the synthesized quinides. This kind of binding may be exploited to develop a selective biosensor for quinides by introducing several molecules of caffeine or other xanthines on a suitable scaffold.

Con il presente lavoro di tesi si è voluta esaminare la fattibilità del processo di digestione anaerobica di diversi substrati organici quali: reflui di birreria, fanghi esausti di impianti di trattamento di acque reflue, colture energetiche, scarti agro-industriali solidi e scarti organici urbani. Questo studio è stato motivato dal grande interesse scientifico ed industriale per l'applicazione della digestione anaerobica, allo scopo di perseguire fini quali: lo smaltimento controllato degli scarti organici e la produzione di energia rinnovabile. Scopo finale del lavoro è stata la valutazione della produzione di metano effettiva e lo sviluppo di un modello matematico semplice, in grado di descrivere acuratamente il processo.

Le nanotecnologie si sono sviluppate molto rapidamente negli ultimi decenni, grazie all’invenzione di un crescente numero di tecniche che permettono di lavorare su scala nanometrica. Il grande interesse in quest’area trae origine dalle sue svariate possibili applicazioni in diversi campi, quali l’elettronica, dove la miniaturizzazione ha un ruolo fondamentale, ma la medicina. Infatti, lo sviluppo di un sistema ‘intelligente’ capace di eseguire un compito specifico all’interno del nostro organismo in modo controllato, sia in campo diagnostico che terapeutico, è lo scopo di una nuova branca della ricerca, la nanomedicina. Per raggiungere un così notevole obiettivo, è necessario un vettore di dimensioni nanometriche, e i nanotubi di carbonio (CNTs) rappresentano uno dei migliori candidati. Lo scopo di questo lavoro di tesi era lo studio di questa opportunità e, in particolare, della possibile applicazione di nanostrutture di carbonio per la veicolazione di farmaci. Nell’Introduzione (Capitolo 1), viene fatta una breve panoramica sui CNTs, spiegando le loro più importanti caratteristiche e le questioni fondamentali associate alla loro manipolazione. Vengono descritte le diverse possibilità esistenti per la funzionalizzazione dei CNTs, concentrandosi soprattutto sugli approcci covalenti sfruttati in questa tesi, ossia l’ossidazione e la conseguente amidazione dei gruppi carbossilici così introdotti, e la cicloaddizione 1,3-dipolare di ilidi azometiniche. Sono poi trattate le principali tecniche di caratterizzazione impiegate, illustrandone i vantaggi e le limitazioni. In seguito viene affrontato il tema molto controverso della tossicità dei CNTs, in termini di possibili conseguenze a una loro esposizione e di rischio per chi lavora in questo campo. Infine viene fatto un dettagliato resoconto della letteratura esistente sull’applicazione dei CNTs per la veicolazione di farmaci, ponendo l’accento in particolare sugli svantaggi connessi agli approcci non-covalenti, e focalizzando poi l’attenzione sulle diverse strategie di indirizzamento specifico studiate a oggi nella nanomedicina con i CNTs. Nel Capitolo 2, viene presentato uno studio sull’accorciamento di nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNTs), come strategia per ottenere un materiale con migliori caratteristiche di solubilità, estremamente importante per qualsiasi applicazione biomedica. Vengono esplorate due diverse possibilità. Nella prima parte, si descrive il trattamento ossidativo di SWCNTs con una miscela di oleum e acido nitrico, e la loro completa caratterizzazione, per la produzione di nanotubi accorciati e disaggregati, recanti funzioni carbossiliche, con un grande miglioramento nella dispersibilità. In seguito viene descritto un trattamento basico per la rimozione delle impurezze carboniose amorfe introdotte dall’ossidazione. In aggiunta, viene riportato per la prima volta un fenomeno di ri-pristinizzazione dei SWCNTs ossidati, mediante trattamento laser. La seconda parte del Capitolo 2 riguarda l’accorciamento meccano-chimico di SWCNTs, come alternativa all’approccio in soluzione. Vengono mostrate diverse caratterizzazioni complementari dei SWCNTs ottenuti, sottolineando la possibilità, molto interessante, di controllare la qualità del prodotto finale variando le condizioni sperimentali. Il Capitolo 3 tratta la coniugazione covalente di CNTs e anticorpi (Abs), con lo scopo di valutare due diverse opportunità. Gli anticorpi, infatti, possono mediare l’indirizzamento specifico di un nanovettore a base di CNTs, con possibili applicazioni terapeutiche e diagnostiche. Viceversa, i CNTs possono mediare l’internalizzazione cellulare degli Abs, aprendo così la strada a svariate possibilità terapeutiche a livello intracellulare, a oggi inesplorate. La preparazione di diversi coniugati covalenti Ab-CNT viene descritta, utilizzando nanotubi a parete doppia (DWCNTs) o multipla (MWCNTs), e sia Abs interi, sia frammenti degli stessi. Inoltre viene descritta una doppia funzionalizzazione dei CNTs, volta a introdurre simultaneamente una sonda necessaria per gli studi biologici. Vengono poi presentate diverse caratterizzazioni complementari dei coniugati, per dimostrare l’efficacia della strategia covalente adottata, e la preservata capacità dell’Ab legato ai CNTs di riconoscere il suo specifico antigene. Infine, vengono presentati alcuni risultati biologici preliminari. Nel Capitolo 4, viene descritta la funzionalizzazione del fullerene C60 e dei CNTs, sia pristine che ossidati, per lo studio della veicolazione della doxorubicina, un farmaco antineoplastico. Il farmaco viene legato sia in maniera diretta che indiretta, mediante l’introduzione di una catena peptidica scindibile a livello intracellulare, al fine di mediarne il rilascio. Viene data una dettagliata descrizione delle procedure sintetiche adottate, oltre alla caratterizzazione spettroscopica di tutti i composti preparati. Infine vengono illustrati i primi risultati biologici ottenuti sui derivati fullerenici. In conclusione, il presente lavoro di tesi descrive la funzionalizzazione di diversi tipi di CNTs mediante un approccio covalente, con un’analisi critica dei risultati, tramite l’utilizzo di svariate tecniche di caratterizzazione. Tutti i derivati preparati trovano potenziale applicazione nel campo della nanomedicina, contribuendo alla comprensione e allo sviluppo di questa scienza così affascinante e promettente.

I Nanotubi di Carbonio (CNT) sono una nuova forma allotropica del carbonio scoperta da Ijiima nel 1991, che li ha individuati nel materiale di scarto proveniente dalla produzione dei fullereni. Essi sono costituiti da un foglio di grafene arrotolato su se stesso a formare una struttura cilindrica chiusa alle estremità. I nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT) sono costituiti da un solo foglio di grafene, mentre i nanotubi di carbonio a parete multipla (MWCNT) sono formati da due o più fogli concentrici. Per via delle loro eccezionali proprietà chimico-fisiche, per esempio la forza meccanica superiore a quella di qualsiasi materiale conosciuto, la stabilità termica, la grande area superficiale, il basso peso specifico e le loro ottime proprietà di conduzione dell’elettricità; i CNT hanno trovato negli scorsi 20 anni un largo impiego nel campo delle scienze dei materiali, ma anche, alla luce della loro capacità precedentemente riportata di attraversare la membrana cellulare e della loro bassa citotossicità, nel campo della biomedicina, in applicazioni come il trasporto mirato di farmaci e la biosensoristica. In questo lavoro di tesi, si riporta l’uso dei nanotubi di carbonio in neurobiologia/neurofisiologia come substrato per lo studio dell’interazione tra cellule nervose e i nanotubi di carbonio stessi. In particolare, la loro struttura tubulare e le dimensioni nanometriche, associate con la loro conduttività elettrica e la loro biocompatibilità, li rendono un materiale ideale per l’associazione e l’integrazione con le cellule nervose, richiamandone sia la struttura che le proprietà. Questo potrebbe aprire la possibilità di usare i nanotubi di carbonio come materiale per la costruzione di nanoporotesi atte a riparare il tessuto nervoso dove danneggiato. I risultati ottenuti hanno dimostrato che cellule nervose cresciute su una superficie di nanotubi di carbonio mostrano un incremento della frequenza delle correnti sinaptiche spontanee e dei potenziali d’azione spontanei. Pù in dettaglio, i nanotubi di carbonio migliorano la risposta dei neuroni formando dei contatti molto intimi con la membrana della cellula nervosa. Questi contatti potrebbero favorire una facilità di comunicazione elettrica tra i vari compartimenti del neurone. Al fine di interpretare meglio la natura dell’interazione fisica tra le cellule nervose e i nanotubi, abbiamo sviluppato un metodo per preparare superfici di vetro funzionalizzate covalentemente con nanotubi di carbonio con una morfologia definita e riproducibile. I nanotubi di carbonio sono stati purificati e processati opportunamente tramite funzionalizzazione organica per fornirli dei gruppi funzionali necessari all’ancoraggio sulla superficie del vetro mediato da organosilani come agenti di coupling. Inoltre i nanotubi sono stati funzionalizzati mediante un peptide RGD caratterizzato dalla sequenza amminoacidica arginina-glicina-acido aspartico, una sequenza che si ritrova normalmente in vivo nelle proteine di adesione e che rappresenta un substrato tipico per la promozione dell’adesione e lo sviluppo neurale. Anche questi nanotubi biofunzionalizzati sono stati attaccati covalentemente alla superficie del vetro mediante l’uso di organo-silani. Tutte le superfici preparate sono state caratterizzate con angolo di contatto, spettroscopia FT-IR, microscopia SEM e spettroscopia XPS. L’uso di questi substrati per lo studio della crescita e del comportamento neurale dovrebbe portare ad una valutazione più precisa degli effetti che i nanotubi di carbonio hanno sulla rete neurale. Inoltre la definizione di un metodo efficiente e versatile per l’attacco covalente di nanotubi di carbonio su superfici inorganiche è di fondamentale importanza per la eventuale costruzione di superfici biocompatibili impiegabili nell’ingegneria tessutale. Tra tutte le motivazioni che rendono i nanotubi un materiale eccellente per l’integrazione con le cellule nervose riportiamo anche uno studio sistematico in vitro su reti ibride di neuroni e MWCNTs. Abbiamo ottenuto la deposizione di un film sottile di CNTs sulla superficie elettrodica dei MEA, (microelectrode arrays), che sono supporti solidi forniti di una matrice di 60 elettrodi utilizzati comunemente in neurofisiologia per la stimolazione nervosa simultanea di molti siti contemporaneamente. Utilizzando questi MEA coperti da CNT come substrati per la crescita neuronale abbiamo avuto la possibilità di esaminare a livello di comunicazione sinaptica il modo in cui i CNT e le cellule nervose interagiscono in maniera direzionale con l’emergenza dell’attività sinaptica spontanea, come precendentemente osservato a livello della singola cellula. Nell’appendice di questa tesi è riportato uno studio riguardante la funzionalizzazione di nanotubi di carbonio mediante una sonda fluorescente, e la relativa caratterizzazione dei derivati per lo studio della loro internalizzazione e distribuzione nelle cellule nervose. Risultati preliminari hanno mostrato che i CNT sono in grado di passare la membrana cellulare del neurone e si distribuiscono omogeneamente nel citoplasma ma non penetrano nel nucleo della cellula. Questo è un risultato molto importante perchè, nonostante sia stata precedentemente dimostrata la capacità dei nanotubi di attraversare la membrana cellulare, nulla ancora è stato detto a riguardo delle cellule nervose. La possibilità da parte dei nanotubi di carbonio di attraversare la membrana ematoencefalica potrebbe definire una nuova frontiera nell’uso dei CNT in neurofisiologia come sistemi di veicolazione mirata di farmaci nel sistema nervoso centrale e costituire, eventualmente, un importante strumento per le applicazioni terapeutiche riguardanti le malattie degenerative del sistema nervoso. Ulteriori sviluppi di questo studio potrebbero essere la verifica, in vivo della capacità dei CNT di attraversare la barriera ematoencefalica.

Carbon nanotubes (CNTs) are a new form of carbon discovered in the ’50/’60, but described at the atomic level only in 1991 by Iijima. CNTs are constituted by one or more rolled up graphene sheets and they can be classified in single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) or multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs). The peculiar properties of CNTs, characterized by their physical, chemical and mechanical properties, by their thermic conductivity and their large aspect ratio, rendered this material a promising candidate in several research fields, such as material science and nanotechnology. Recently, it has been discovered that CNTs have the ability to be uptaken by different types of human cells with a typical non-energy dependent mechanism called “nanoneedle”. This new property rendered CNTs a promising candidate as a vector for drugs. In this context, during my thesis I focused on the functionalization of carbon nanotubes bearing cationic moieties, in order to study their ability to complex the genetic material for a potential gene therapy. In the first part of the thesis MWCNTs were functionalized with different cationic dendrons and their capability to interact with plasmid DNA and siRNA (small interfering RNA) was evaluated. In the second part of the thesis, I focused on the functionalization of MWCNTs with a targeting peptide for mitochondria and the consequent possibility to use these conjugates as gene delivery system in mitochondrial diseases. Initially, a library of compounds with a ramified structure was synthesized. Dendrons of zero, first and second generation were obtained, bearing at their termini ammonium or guanidinium moieties, for the interaction with the genetic material. Two groups of dendrons were synthesized with two different functions at their core: i) an amine or ii) an azide. This was realized in order to have the possibility to link the dendrons to CNTs, exploiting two covalent approaches, the amidation reaction or the “click” reaction, respectively. In parallel a non-covalent approach was also investigated, coupling by “click” reaction a dendron of first generation to a pyrene bearing an acetylenic group. The resulting molecule was then adsorbed on the surface of MWCNTs, exploiting the known ability of pyrene to interact with nanotubes through “π-π stacking”. The conjugates obtained in this way were characterized by complementary techniques, such as thermogravimetric analysis, Kaiser test and transmission electron microscopy, allowing in this way to assess the degree of functionalization of CNTs and to observe their morphology. The ability of these conjugates to complex plasmid DNA and siRNA was studied through agarose gel electrophoresis using different charge ratios of genetic material and cationic CNTs. Preliminary cellular studies on guanidinium derivatives, to evaluate the effective ability of the conjugates to be internalized into human cancer cells (A549 cells), were performed in collaboration with Prof. K. Kostarelos and Dr. K. T. Al-Jamal in London. Further studies are currently under development to determine the aptitude of the derivatives to carry and deliver siRNA inside cells. The efficient gene silencing and the eventual cytotoxic effects of MWCNTs conjugates will be also studied into human cells. In the second part of the thesis, we focused on the development of a new gene delivery system able to direct the genetic material inside mitochondria, for a possible treatment of genetic diseases caused by mutation in the mitochondrial genome. To this purpose MWCNTs were functionalized with a targeting peptide (mitochondrial target sequence peptide, MTS) able to direct CNTs into mitochondria. The effective internalization of the material inside macrophages (RAW 264.7) and human cancer cells (HeLa cells) and their subcellular localization were studied through different microscopic techniques. Using confocal microscopy it was possible to observe a co-localization of CNTs and mitochondria, then confirmed also by TEM images. This latter technique permitted also to evaluate the possible mechanism used to internalize CNTs: i) “nanoneedle” mechanism and ii) phagocytosis (for macrophages) or endocytosis (for HeLa cells). In order to shed further light on the ability of CNTs to interact with mitochondria, nanotubes were double functionalized with the targeting peptide MTS and with a mitochondrial toxic peptide, called sVpr. The toxic effects of this material, in comparison with CNTs functionalized just with the toxic peptide, were studied on isolated mitochondria. The internalization of different conjugates into isolated mitochondria was then analysed by TEM. This work has been performed in collaboration with Prof. P. Bernardi (Università degli Studi di Padova). In order to obtain a system able to complex DNA, a double functionalization of CNTs was developed, coupling to the carbon material the targeting peptide MTS and a dendron, for the complexation of genetic material. The ability of this conjugate to interact with plasmid DNA was then verified through agarose gel electrophoresis, revealing its potentiality as efficient gene delivery system. In conclusion, in this work MWCNTs were functionalized with cationic dendrons, showing their ability to interact with the genetic material. Moreover when incubated into cells, the aptitude of MWCNTs, functionalized with a targeting peptide, to be directed in the proximity of mitochondria and to localize in their interior was demonstrated using different microscopic techniques. These results show the potentiality of this material in the field of nanomedicine, resulting a promising vector in gene therapy.

L’argomento della presente tesi si colloca nell’ambito della progettazione e dello sviluppo di materiali per il catodo di SOFCs ed il contributo scientifico che si propone di fornire trova spazio nella necessità di approfondire la conoscenza delle proprietà di materiali presentati in letteratura come promettenti ma non ben caratterizzati, per poter proseguire con la progettazione razionale di nuove composizioni e con la loro relativa caratterizzazione. L’approccio di ricerca adottato è stato quello di approfondire le conoscenze relative ad una famiglia di materiali a struttura perovskitica a base di lantanio, nichel e ferro, cercando di comprendere quali dettagli microstrutturali, morfologici e di composizione chimica possano giustificare un incremento o meno della prestazione elettrochimica sul processo di riduzione dell’ossigeno. La ricerca si è articolata nei seguenti punti: a)sintesi e studio delle caratteristiche della perovskite di composizione chimica LaNi0.6Fe0.4O3 (LNF) come potenziale catodo di SOFCs operative a temperature intermedie; b)studio delle prestazioni elettrochimiche di elettrodi puri e compositi a base di LNF in presenza dei due conduttori ionici YSZ e SDC. La migliore prestazione elettrochimica su semicelle è stata riscontrata per il sistema composito LNF-SDC, per il quale la combinazione dei requisiti di compatibilità chimica e conducibilità mista ionica-elettronica, derivante dalla combinazione dei due materiali al limite ottimale di percolazione, hanno determinato una migliore estensione della TPB; c)progettazione e la caratterizzazione dei materiali La(1-x)SrxNi0.6Fe0.4O3 (LSNF-X) ottenuti per drogaggio della perovskite LNF, con percentuali variabili di Sr; d) caratterizzazione dell’elettrodo composito LSNF-9.0 in presenza di SDC; e)assemblaggio della SOFC completa, utilizzando LNF come catodo, preparata con la tecnica del doppio tape casting, ottimizzata per sistemi a base di YSZ.

State of the art computational thechniques were applied to several current research toppics in biocatalysis such as substrate promiscuity, reaction promiscuity and high throughput mutant generation and screening. The studied subjects are of great interest to industrial biocatalysis nowadays and can find large application for rational redesign of inefficient biocatalysts and fast substrate engineering and screening. The overall work can be devided into three principal areas, i.e. understanding catalytic mechanisms, description of enzyme-substrate interactions and integration of available computational methods for the development of a novel authomatized tool for enzyme engineering. In each of these areas, the goal has been to test the existing methodologies as well as the development of new descriptors and ready to use strategies.

The regulation of transmembrane ion transport is a fundamental aspect of bioinspired chemistry which may find relevant applications in different fields ranging from pharmaceutics to sensing. In this contest the ability to form stable and well organized structures able to produce large and well defined pore in the membrane appears really promising. Several examples of such systems are present in the literature, usually formed in self-assembling processes mediated by hydrogen bonding, charge repulsion, and ion pairing. Coordination chemistry, however, has appeared only occasionally in design strategies for synthetic ion channels and pores. Recently Kobuke reported synthetic nanopores based on covalent adduct of porphyrins having six carboxylic acid groups directed up and down; the formation of hydrogen bonds between two monomers promotes their stacking and the formation of a nanopore able to span the lipid bilayer. The covalent approach for this type of macromolecules is synthetically laborious and the developments are therefore limited. In this context, the self-assembly approach, in which the macromolecules are generated by self-assembly of small and more synthetically accessible building blocks, is an attractive way to achieve the aim. In this field trans-porphyrin provides a linear substitution pattern that can be used for the construction of porphyrin-based architectures with a well-defined structure by metal mediated self-assembly. We have started a research project aimed to design synthetic metal-organic nanopores derived from the self-assembling of porphyrin ligands with proper metal fragments. In our first approach we have used trans-dipyridylporphyrins (linear difunctional ligands) which, upon binding with metal fragments such as Re(I) or Pd(II) (cis-coordinant metal fragments) may form supramolecular boxes (4+4 type). Subsequently, the porphyrins have been functionalized with groups able to give hydrogen bonds after appropriate modification, such as esters. A second part of the work was focused on the study of the ionophoric activity of the prepared compounds. Activity studies have been conducted on porphyrins and molecular squares using liposomes as models of biological membranes. Porphyrins and molecular squares without groups able to give hydrogen bonding do not show ionophoric activity. This behavior was expected because the dimension of these systems does not allow to span completely the lipid bilayer and there are not weak interactions that promote the self-assembly of the monomers. On the contrary, excellent ionophoric activity was observed with the molecular square bearing carboxylic acid. Thus, presence of hydrogen bonding groups that enable the formation of tubular, probably dimeric, structure are essential for forming the transmembrane nanopore. Ionophoric activity can be inhibited by using polyamino-dendrimers and this ability is function of their dimension. Parallel to the development of supramolecular porphyrins based nanopores, in the course of my PhD period, I studied also the ionophoric activity of cyclic phosphate-linked oligosaccharide analogues (CyPLOS) and guanosine-based amphiphiles in collaboration with prof.ssa Daniela Montesarchio, Department of Organic Chemistry and Biochemistry, University “Federico II” of Napoli.

Negli ultimi 50 anni, l’uomo ha attribuito un valore crescente alla ricerca scientifica in quanto strumento di innovazione e di evoluzione tecnologica. La Scienza è diventata uno strumento in grado di migliorare la qualità di vita dell’uomo portando svariate migliorie, ma anche di cambiare radicalmente il suo stile di vita a seguito di scoperte e di strumenti sconosciuti prima di allora. Il progresso tecnologico, la crescita della popolazione mondiale e delle sue esigenze ha causato degli squilibri nel nostro pianeta, dovuti soprattutto and una non omogenea distribuzione delle risorse, in primis quelle energetiche. Dunque, il ruolo della ricerca scientifica contemporanea ha assunto un’ulteriore valenza, quello di appianare gli squilibri sociali ed economici del pianeta. La ricerca di nuove risorse energetiche, o di vettori nei quali conservare l’energia, è uno dei campi scientifici più fertili; in accordo con le ultime tendenze, massima importanza è riposta nelle tecnologie in grado di convertire l’energia solare e renderla disponibile sotto altre forme più pratiche (procedure di storage più semplici) o più facilmente manipolabili. La scelta di sfruttare l’energia solare si basa su alcuni presupposti logici: (i) abbondanza, (ii) distribuzione pressoché uniforme dell’energia solare sulla superficie del pianeta, (iii) esempi disponibili nel mondo naturale che possono essere studiati, compresi, migliorati. La fotosintesi clorofilliana è sicuramente il processo naturale maggiormente conosciuto; perpetrato da una fetta consistente di forme di vita (in particolare del mondo vegetale), permette a queste di sfruttare l’energia contenuta nella radiazione solare e trasformare acqua ed anidride carbonica in carboidrati (la loro riserva di energia) ed ossigeno. Ispirandosi a questo modello, la scienza dei materiali è alla continua ricerca di substrati in grado di trasformare la luce solare in altri vettori energetici a partire da sostanze semplici ed ampliamente disponibili. La scissione dell’acqua in idrogeno ed ossigeno molecolari è uno di questi possibili traguardi; l’acqua è estremamente abbondante sul nostro pianeta (ricoprendone ben il 69% della sua superficie), l’idrogeno è un combustibile che promette di sostituire i derivati del petrolio nel prossimo futuro, e l’ossigeno è di estremo interesse in quanto fonte stessa della vita sul nostro pianeta, almeno nella forma da noi conosciuta. Il progetto di ricerca descritto in questa tesi pone le basi su queste premesse. L’obiettivo prefissato è stato quello di progettare, realizzare, caratterizzare e testare materiali in grado di attuare processi fotosintetici. Durante la fase di progettazione, si è stati costretti a ragionare su quale potesse essere la classe di materiali appropriata a tale scopo, e ci si è orientati verso nano-ibridi organici/inorganici per una serie di motivi: (i) le (nano)-dimensioni avrebbero permesso di lavorare con precursori molecolari e pilotare con maggiore facilità la fase sintetica; (ii) questa classe di materiali possiede generalmente elevate aree superficiali; (iii) l’uso di materiali organici ed inorganici avrebbe permesso di scegliere building blocks che potessero offrire ciascuno le caratteristiche migliori della loro classe di appartenenza. Il lavoro di tesi si è dunque articolato in due sezioni fondamentali: • determinazione di una classe appropriata di cromofori capaci di catturare efficientemente la luce solare ed attivare una specie catalitica ad essi accoppiati. Relativamente a questo punto, scopo non secondario è stato quello di sviluppare nuovi cromofori rispetto a quelli attualmente riportati nella letteratura scientifica e/o sviluppare nuovi protocolli di sintesi capaci di migliorare rese ed efficienza dei processi attualmente noti • scelta di una appropriata specie catalitica e sviluppo dei materiali ibridi contenenti il/i fotosensibilizzanti e il/i catalizzatori; una volta isolata la potenziale diade, si sarebbe proceduto con la fase di monitoraggio dell’attività fotocatalitica del nuovo materiale. Nello sviluppo di questo progetto, i derivati peilenici sono stati scelti quali potenziali fotosensibilizzanti in virtù di una interessante combinazione di caratteristiche elettroniche e chimico-fisiche (approfonditi nel Capitolo 2), ed in particolare ci si è concentrati su composti solubili in acqua. Quest’ultimo dettaglio non è da sottovalutare in quanto, nell’ottica di effettuare i test finali di scissione ossidativa dell’acqua, l’uso di composti idrofilici avrebbe permesso di utilizzare al contempo l’acqua quale reagente e mezzo di reazione. Prima giungere a questa fase, la chimica dei perileni è stata scandagliata a fondo, e vari derivati sono stati isolati e caratterizzati utilizzando protocolli di sintesi sia classici che innovativi (Capitolo 4). La parte centrale del lavoro di tesi ha riguardato lo studio delle diadi costituite da uno dei perileni isolati (PBI2+) e due diversi catalizzatori: (i) Ru4POM, catalizzatore molecolare a base di rutenio, testato per esperimenti sia in fase omogenea che per la realizzazione di un ibrido tri-componente per futuri studi di elettrocatalisi (Capitoli 5-6); (ii) nanoparticelle di ossido di iridio per la preparazione di fotoanodi da applicare in celle fotoelettrochimiche (Capitolo 7). La confidenza acquisita coi derivati perilenici ha permesso di sviluppare anche progetti paralleli che non riguardassero applicazioni in ambito energetico; un dettagliato studio di perileni bisimmidi quali SERS markers è trattato nella parte finale di questa tesi (Capitolo 8).

Artificial molecular structures forming stable pores in biological membranes may have important applications in the biomedical field and in the field of biotechnology, in particular as sensors. These structures have to meet specific characteristics of size, shape and solubility. In particular, they have to enter the membrane engaging hydrophobic interactions with the phospholipid bilayer and, at the same time, forming a polar conduit for the transport of the ions across the membrane. A molecular structure which meets these features is an amphipathic, rigid and tube-shaped one and, mostly important, long enough to span the entire membrane. The final goal of this thesis work is the design and preparation of structures that would reflect these characteristics obtained by the metal-mediated self-assembly of pyridylporphyrins. In particular to obtain structures long enough to span the membrane the focus was on the design of pyridylporphyrins equipped with complementary hydrogen bonding donor/acceptor moieties and of a polar subunit to increase membrane compatibility. Using transition metal complexes with an adequate geometry these “molecular panels” should self-assemble in metallasquares which, upon hydrogen-bonding driven dimerization in membrane, should form tubular empty structures long enough to span the phospholipid bilayer forming large pores. In the first part of the Thesis work, a versatile and straightforward synthetic strategy for the preparation of a library of amphiphilic trans-A2B2 and trans-A2BC dipyridylporphyrins directly from 5-(4-pyridyl)dipyrromethane has been developed and optimized. The major part of the porphyrins synthesized in this way are new compounds.The library members have been functionalized through different metal catalysed coupling reactions, showing their great potential and versatility towards the different employment which could be addressed, to obtain amphiphilic and dimeric derivatives, in some cases with very good and satisfying yields. The derivatization reactions have been performed on the free base porphyrins and, therefore, it has been necessary to carefully optimize the conditions of the metal catalysed reactions in order to avoid the insertion of the catalyst, or of the co-catalyst, in the porphyrin macrocycle. The functionalities that have been inserted into the dipyridylporphyrins scaffold are hydrogen-bonding complementary donor/acceptor moieties, like uracil and diacylaminopyridine, and an amphiphilic polyether chains. Starting from the porphyrin library and exploiting metal catalysed coupling reaction also three dipyridylporphyrins dimers have been prepared. The target amphiphilic dipyridylporphyrins have been principally utilized in self-assembly reactions exploiting the pyridyl groups present, in particular through the coordination-driven self-assembly approach, with cis-coordinating metal complexes like Re(CO)5Br and trans,cis,cis-[RuCl2(CO)2(DMSO-O)2], leading to the formation of molecular squares together with other kind of metallacyclic species. At the best of our knowledge, this is the first time that the Ru(II) complex have been employed for the self-assembly with trans-dipyridylporphyrins. The porphyrins, the dimers and supramolecules synthesized have been mainly characterized by mean of NMR spectroscopy, in particular through 1H, 13C, 1H-1H COSY, 1H-13C HSQC, 1H-DOSY. The latter technique, being more and more important and utilized in supramolecular chemistry either in the characterization either in the sample purity proof of the compounds, has been in fact thoroughly utilized both to confirm the dimensions in solution of all the molecules synthesized and to give an evidence of their purity. This last feature has been one of the more challenging to face because the sample purity was not so evident just analysing the 1H-NMR spectra due to the possible presence of isomers and conformers. In absence of X-ray spectroscopic and MS spectrometric data, PFG-NMR has been a powerful, helpful and straightforward way to rationalize the high complexity of the resonating signals pattern in these spectra and to confirm the higher molecular dimensions reached as relative to the parent porphyrins. Confirmation of the pyridyl-metal bond formation with the right configuration has come also from IR, UV-Vis and fluorescence emission spectra acquired both for the porphyrins and for the supramolecular metallacycles. Putting together all the data and although in some cases we were not able to unambiguously define the nuclearity of the metallacycle, the supramolecules synthesised have all cyclic and symmetric structure and retain the symmetry of their parent porphyrins.The most representative porphyrins, together with the supramolecular metallacycles have been then tested as transmembrane ion channels utilizing liposomes as model of biological membranes. Preliminary studies on the H+ transport assays have been reported.

La nanotecnologia è chiamata a rivoluzionare molti settori della nostra vita. Tra tutti i campi in cui è convolta, la ricerca delle energie rinnovabili, la possibilità di ottenere acqua pulita in tutte le parti del mondo, il miglioramento della salute e l’aumento dell’aspettativa di vita e lo sviluppo di sistemi informatici, sono gli obiettivi che si distinguono. Le nanostrutture di carbonio sono materiali promettenti che possono aiutare a raggiungere questi obiettivi: includono fullereni, grafene, nanotubi e nanohorns di carbonio. Tutti hanno proprietà interessanti e offrono nuovi vantaggi per le applicazioni in chimica dei materiali e nella medicina. Il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato interessanti metodi per modificare queste nanostrutture per poterli applicare nei campi sopra menzionate. In questo contesto, lo scopo generale di questa tesi è il disegno di sistemi multifunzionali basati su nanostrutture di carbonio destinati ai sensori e alle applicazioni biologiche. Nel capitolo 1, viene fatta una breve panoramica dei nanotubi e i nanohorns di carbonio, spiegando la loro struttura, le loro proprietà e le loro applicazioni. Inoltre, vengono descritte le diverse strategie per la loro funzionalizzazione. Il riconoscimento molecolare gioca un ruolo importante in molti sistemi biologici. In flavoproteine, l'interazione specifica tra il cofattore flavina e l’apoenzima determina la reattività della proteina. Di conseguenza, la modulazione dell'ambiente delle flavine può essere utilizzata come strumento per determinare il loro comportamento e anche per comprendere i processi molecolari negli enzimi. Con questi obiettivi in mente, nel capitolo 2 è descritta la sintesi di differenti derivati basati sul sistema nanotubi di carbonio-triazina per l’uso come ricevitori di riboflavina. In primo luogo, la sintesi e la caratterizzazione di diverse 1,3,5-triazine sono riportate. In una seconda fase, viene descritta la funzionalizzazione di nanotubi di carbonio a parete singola e a parete multipla con le differenti triazine e anche con catene di p-tolil, impiegando le radiazioni microonde. Dopo, si riporta la caratterizzazione completa di questi derivati con varie tecniche. L’auto-assemblaggio degli ibridi è stato analizzato con microscopia elettronica a trasmissione, osservando come i funzionalizzati con 1,3,5-triazine formano buone dispersioni in acqua, mentre loro si auto-assemblano in solventi non polari a causa del riconoscimento di legami d’idrogeno complementari. Tuttavia, derivati funzionalizzati con p-tolil formano migliori dispersioni in solventi organici ed invece si auto-assemblano in acqua. Viene poi studiata la capacità dei nanotubi di carbonio funzionalizzati a parete multipla di riconoscere la riboflavina con la spettroscopia di fluorescenza e ultravioletta visibile, analizzando la grandezza delle interazioni non-covalenti. Si vede come la funzionalizzazione covalente dei nanotubi di carbonio diminuisce la loro capacità di formare interazioni  mentre le interazioni di legame d’idrogeno giocano un ruolo fondamentale nel processo di riconoscimento tra i membri del sistema. Inoltre, si è demostrata l’influenza dei tipi di triazine nel comportamento della riboflavina. In questo modo, è dimostrata la modulazione del riconoscimento molecolare della riboflavina attraverso i diversi nanotubi. Così, recettori artificiali in processi di catalisi possono essere specificamente disegnati per ottenere il controllo delle interazioni tra i nanotubi di carbonio funzionalizzati e la riboflavina, modificando il suo comportamento. Inoltre, le dimensioni e le eccellenti proprietà di nanotubi permettono di utilizzarli come strumento nella progettazione di sensori per la rivelazione di singole molecole. Nel capitolo 3 si riporta la modifica di nanohorn di carbonio per l'impiego come farmaci selettivi nella terapia del cancro è rapportata. Prima, si mostra la sintesi e la caratterizzazione di diversi ibridi di nanohorn: Antibody-CNH, Drug-CNH, Antibody-Drug-CNH e Double Functionalized-CNH. In particolare vengono usati cisplatino, come profarmaco, ed un anticorpo specifico per le cellule che mostrano l’antigene PSMA (Prostate-specific membrane antigen). Di seguito, vengono presentati diversi esperimenti biologici sviluppati in collaborazione con il professor Marco Colombatti dell’Università degli Studi di Verona (Italia). L’ibrido Antibody-Drug-CNH possiede una migliore capacità di uccidere selettivamente le cellule che presentano l'antigene PSMA, rispetto ad altri derivati di nanohorns. Il nuovo sistema progettato offre un grande potenziale dato dalla possibilità di modificare il tipo e il grado di funzionalizzazione. Questo permette di variare la quantità di farmaco o di anticorpo nelle nanostrutture con lo scopo di migliorare l’efficienza dei nuovi derivati. Inoltre, questo metodo può incorporare altri farmaci o anticorpi al sistema, aprendo la porta al trattamento di altre malattie. Il capitolo 4 descrive l'applicazione di diverse nanostrutture di carbonio nella terapia genica. Prima, si mostra la funzionalizzazione di nanohorns di carbonio con gruppi amminici, impiegando diversi metodi che utilizzano le radiazioni a microonde (cicloaddizione 1,3-dipolare e addizione radicalica). In seguito, viene presentato il lavoro svolto in "the Nanomedicine Lab" (Università di Manchester), sotto la supervisione del Prof. Kostas Kostarelos. L'efficacia dei nanohorns di carbonio funzionalizzati per formare complessi con siRNA è comparata con quella dei nanotubi di carbonio forniti dal gruppo del professor Kostarelos. Si è visto come i nanohorn di carbonio formino complessi con siRNA a differenza dei nanotubi. I complessi siRNA/nanohorn si caratterizzano utilizzando varie tecniche e viene analizzata la loro capacità di rilasciare il siRNA. Sebbene nanohorn di carbonio funzionalizzati con l’addizione radicalica mostrano una forte interazione con il materiale genetico, i derivati funzionalizzati con la cicloaddizione 1,3-dipolare lo rilasciano più facilmente. I risultati suggeriscono che, per conseguire il miglior carrier, la complessazione totale del siRNA con le nanostrutture dovrebbe essere evitato. Tuttavia, gli ibridi devono essere analizzati in vitro per garantire la migliore scelta. Questo studio contribuisce alla comprensione dell’uso di nanohorn di carbonio come vettori per terapia genica; ma, un maggior numero di derivati deve essere analizzato per un confronto completo con i nanotubi di carbonio.  

In a sustainable energy economy, hydrogen will become very important as it is considered one of the key energy carriers in terms of energy content, as fuel for transportation and intermediate in the conversion of renewable energy sources. The aim of this work was the design of novel catalysts for hydrogen production from both methane and methanol- ethanol/water streams. Special interest was also focused on the CO2 hydrogenation reaction, as a potential chemical route to its valorization to mitigate its greenhouse effect. Active catalysts, resistant to the sinterization under severe reaction conditions, were developed through a simple and low cost synthetic route, which was based on the encapsulation of pre-formed Rh nanoparticles into porous oxides. This procedure reduces the mobility of the metal particles at high temperature. The embedded catalysts, tested for the methane partial oxidation, presented higher thermal stability with respect to a reference catalyst obtained by conventional incipient wetness impregnation. In order to obtain a better understanding of the interaction between Rh nanoparticles and the alumina support in the embedded catalysts, an X-Ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) study on three model embedded Rh systems was performed. The extension of the embedding approach to Ni/Cu-based systems was also handled. In addition, Ni(x%)Cu(y%)/Al2O3 catalysts with different Ni and Cu contents were synthesized using the conventional impregnation method. All the samples were tested towards the partial oxidation of methane and the steam reforming of methanol and ethanol. Neither copper nor nickel alone supported on alumina appeared as suitable catalysts for ethanol steam-reforming at low temperatures (T < 500 °C). The activity of the bimetallic systems, during the first run-up experiment, is not very different from the monometallic Ni system. Furthermore, the Ni:Cu ratio does not seem to affect the product distribution. Notably, the bimetallic systems show promising catalytic activity in the methanol steam reforming. Finally, the formation of metal alloys between Cu and Ni, after high temperature reduction, leads to a strongly reduction of coke deposition under methane partial oxidation conditions, increasing the life-time of the catalyst. On Ni(x%)Cu(y%)/Al2O3 samples, CO2 hydrogenation was also investigated. All catalysts did not show the ability to activate the CO2 molecule, as well as the corresponding unsupported systems. No CO was observed if hydrogen was not introduced into the stream. These results are in good agreement with the data obtained on Ni single crystal (Ni(110)), under UHV conditions. In this case, stable hydrogenation intermediates/products were observed during the reaction by means of X-Ray Photoelectron Spectroscopy (XPS), Temperature Programmed Desorption (TPD) experiments and High Resolution Electron Energy Loss Spectroscopy (HREELS) in the -180/230 °C temperature range. The evolution of the surface species and concentrations as a function of the annealing temperature were examined. This work was supported by parallel DFT calculations, in order to model both experimentally and theoretically the CO2 hydrogenation reaction.

Si riporta le sintesi mediata da metalli (Ru(II) e Re(I)) di nuovi addotti supramolecolari di porfirine aventi proprietà fotofiche. Si riporta in dettaglio la loro preparazione, sintesi e caratterizzazione in fase liquida e in fase solida.

RIASSUNTO L'adenosina è un nucleoside endogeno che svolge svariate funzioni sia in condizioni fisiologiche che patologiche interagendo con recettori accoppiati a proteine G denominati recettori adenosinici. Essi si suddividono in 4 sottotipi: A1, A2A, A2B ed A3. Antagonisti per i vari sottotipi recettoriali hanno un diverso possibile impiego terapeutico. L'antagonismo verso il sottotipo recettoriale A1 può essere sfruttato per avere un effetto diuretico ma anche in disordini cognitivi come la malattia di Alzheimer. Antagonisti A2A hanno un effetto neuroprotettivo e quindi sono utilizzabili in malattie neurodegenerative; inoltre esiste un accoppiamento negativo tra i recettori A2A e D2 della dopamina che negli ultimi anni ha spinto alla ricerca di potenti antagonisti verso il sottotipo recettoriale A2A per combattere la malattia di Parkinson. L'antagonismo verso A2B ha un possibile impiego nell'asma e nella terapia contro il diabete. Infine A3 antagonisti sono in grado di abbassare la pressione intraoculare, effetto utile nel casi di glaucoma. A ciò si aggiunge il fatto che tali recettori sono presenti in alte concentrazioni in molte linee tumorali, e recentemente molti sforzi sono stati fatti per comprendere il ruolo di tale sottotipo recettoriale nella genesi e progressione tumorale. In questo lavoro è stata svolta un'analisi approfondita sul ben noto nucleo pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinico che in passato ha portato a potenti antagonisti soprattutto verso A2A e A3. Sono state investigate le posizioni 5, dove non erano mai state inserite catene non aventi un gruppo carbonilico, e la posizione 2 dove è stato introdotto un fenile variamente sostituito al posto del ben noto furano, che rappresenta invece un punto di instabilità metabolica. In aggiunta si è cercato di trovare un punto di ancoraggio per molecole fluorescenti in modo da ottenere delle sonde recettoriali con possibili applicazioni per la localizzazione e lo studio del recettore stesso. Essendo però tale nucleo di natura complessa che comporta una difficile sintesi ma anche poca solubilità in acqua, è stato applicato un approccio di semplificazione molecolare sintetizzando derivati di natura 1,2,4-triazolo [1,5- a]-1,3,5-triazinica, 1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinica, stilbenica e stirilfuranica; in ordine di semplificazione crescente. Infine sono state realizzate alcune serie di composti come test set per la validazione di modelli computazionali che hanno lo scopo di predire contemporaneamente affinità e soprattutto selettività verso i vari sottotipi di recettori adenosinici. ABSTRACT Adenosine is an endogenous nucleoside which possesses different physio-pathological actions that were obtained through its interaction with G-protein coupled receptors, named adenosine receptors. There are four different adenosine receptors subtypes: A1, A2A, A2B and A3. Antagonists at the various adenosine receptor subtypes have a different possible therapeutic applications. A1 antagonists are useful as diuretic drugs but also in cognitive disorders such as Alzheimer's disease. A2A antagonists are neuroprotective and so they could be used for the treatment of neurodegenerative diseases. In addition, A2A adenosine receptor is negatively-coupled with D2 dopamine receptor, thus leading to the research of new potent antagonists towards A2A adenosine receptor subtype against Parkinson's disease. Antagonism at the A2B receptor have a possible application against asthma and diabete, while A3 antagonism was able to decrease intraocular pressure in patients with glaucoma. In addition, very recently, high levels of A3 adenosine receptors were found in several tumoral lines suggesting an active role of this receptor in tumor genesis and/or progression. In this work the well known pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidine scaffold, that led to potent adenosine receptor antagonists (especially towards A2A and A3 subtypes) was deeply investigated. At the 5 position were introduced amino moieties in order to investigate if affinity could be maintained even if a carbonyl group, which give potency at the A3 and A2B receptor, is lacking. Instead at the 2 position was introduced a phenyl ring instead of the always present furan ring that was metabolically unstable. In addition an anchoring point for fluorescent molecules was investigated in order to obtain receptor probes that could be used for localization and study of the adenosine receptors. The pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidine scaffold possesses a complex nature that leads to a complex synthesis route and a low water solubility, thus it is evident the usefulness of a molecular simplification approach. For this reason we have synthesised 1,2,4-triazolo [1,5- a]-1,3,5-triazine, 1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidine, stilbene and stirylfurane derivatives. In conclusion few series were synthesised as test sets for the validation of computational approaches to predict both selectivity and affinity at the various adenosine receptor subtypes.

Questo documento riporta risultati di calcoli DFT di rilassamenti periodici e di spettri NEXAFS di core su soglia K per taluni sistemi di stato solido attraverso l’utilizzo di una metodologia computazionale ibrida. Appropriati modelli di cluster di tali rilassamenti vengono presi in considerazione per il calcolo degli spettri NEXAFS a livello finito in uno schema di approccio a orbitali molecolari. Il problema a cui ci si indirizza nella fattispecie riguarda la spettroscopia di molecole adsorbite su superfici. La prima parte del lavoro si focalizza sul calcolo di spettri NEXAFS K-edge di molecole di etilene e piridina adsorbite su superficie di silicio Si(100), rispettivamente ai livelli C1s e N1s/C1s per varie polarizzazioni del fascio di sincrotrone incidente, considerando differenti geometrie di adsorbimento in entrambi i casi. Nella seconda parte, viene fatta una scelta differente per cambiare la natura della superficie adsorbente, passando ad Ag(110) e Au(111) con vari addotti di ossigeno molecolare e di 1,4-paradiaminobenzene rispettivamente. Similmente al caso precedente, si effettuano simulazioni DFT di spettri NEXAFS ai livelli O1s e N1s per varie polarizzazioni del fascio di sincrotrone incidente. In tutti i casi si cerca di ottenere il miglior accordo con gli esperimenti considerati. I nostri studi mostrano una ragionevole convergenza degli spettri angolo-risolti calcolati con le loro controparti sperimentali e portano a concludere l’utilità di questo approccio computazionale nella definizione della geometria più probabile dell’adsorbato sulla superficie considerata.

Aim of this thesis is the synthesis of enantiomerically pure ligands for their application in asymmetric catalysis. In particular, the work is focused on the synthesis of three different classes of ligands. Chapters 2 and 3 deal with the synthesis of CNN-pincer and N-Nˈ(bipyridine) ligands respectively, obtained in both enantiomeric forms by stereocomplementary chemoenzymatic methods, while Chapter 4 presents the synthesis of P-N type ligands obtained from L-proline. The activity of the complexes that containing the optically pure synthesized ligands was also investigated.