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INTERAZIONE COMPLEMENTO-ENDOTELIO NELLA FLOGOSI
BOSSI, FLEUR
2005-04-26
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Contributor(s)
PATRIARCA, PIERLUIGI
Abstract
Numerose molecole circolanti nel sangue possono interagire con l'endotelio portando all'attivazione della cascata della coagulazione o all'insorgenza dei fenomeni proinfiammatori. Tra le molecole che possono reagire con le cellule endoteliali (EC) ci sono anche i prodotti di attivazione del sistema del complemento (C). Il sistema del C è un componente dell'immunità naturale, che svolge un ruolo essenziale nella difesa contro agenti infettivi e nella rimozione degli immunocomplessi, e rappresenta un importante mediatore del processo flogistico. L'attivazione della sequenza complementare può avvenire essenzialmente attraverso tre vie che portano prima all'attivazione del C3 e, successivamente, tramite la produzione del C3b, alla formazione delle C5 convertasi. Tale molecola scinde il C5 liberando il C5a ed il C5b, che espone il sito di legame per i componenti successivi. Quando il C5b6 si lega al C7, il complesso va incontro ad una transizione strutturale idrofilica-anfifilica per cui, per alcuni millisecondi, espone siti di legame per i fosfolipidi di membrana. Il complesso C5b67 che si forma sulla membrana di una cellula bersaglio si inserisce nel doppio strato lipidico e lega il C8 ed il C9, che polimerizza formando il MAC (Membrane Attack Complex), e causa la lisi del bersaglio. Se la reazione avviene in fase fluida, il C5b67 perde rapidamente la capacità di legarsi a membrane cellulari attraverso il sito idrofobico e diffonde nel microambiente, mantenendo la capacità di legare i successivi componenti terminali C8 e C9. Si forma così un complesso terminale citoliticamente inattivo (iTCC). Il complesso terminale che si trova in circolo, in seguito alla attivazione del sistema, viene più frequentemente definito SC5b-9, in quanto presenta anche la proteina S o vitronectina. Studi condotti nel nostro laboratorio hanno permesso di documentare che l'iTCC stimola l'espressione di ELAM, di VCAM-le di ICAM-1 sulle EC e promuove la flogosi favorendo l'adesione, la migrazione e l'accumulo tissutale di neutrofili. Il primo obiettivo di questa tesi è stato quindi quello di valutare il contributo dell'iTCC e della sua forma presente nel torrente circolatorio, l'SC5b-9, all'induzione di un'altra manifestazione della flogosi, la permeabilità vascolare. Inizialmente, abbiamo voluto accertare se il complesso potesse promuovere l'aumento della permeabilità endoteliale, utilizzando un modello "in vitro". Abbiamo poi studiato il ruolo dell'endotelio in questo fenomeno andando a considerare quali potessero essere i fattori coinvolti nell'aumento della permeabilità. Sono stati utilizzati particolari inibitori del Platelet-Activating Factor (PAF) e del sistema delle chinine, che risultano essere molecole particolarmente coinvolte nelle risposte endoteliali durante questa fase della flogosi. I dati ottenuti con il modello "in vitro" sono stati supportati anche da esperimenti condotti "in vivo" nel ratto. Infine abbiamo voluto esaminare l'effetto dell' SC5b-9 sull'integrità dell'endotelio utilizzando tecniche di microscopia elettronica a trasmissione su sezioni "ex vivo". La formazione del complesso terminale avviene nel torrente circolatorio, e si deposita su alcuni tessuti in condizioni patologiche. E' noto, infatti, che i componenti complementari, compresi quelli terminali, sono sintetizzati non solo dalle cellule epatiche ma anche da molte altre cellule presenti nei tessuti, come macrofagi, fibroblasti e cellule endoteliali. Studi condotti nel nostro laboratorio avevano dimostrato che le HUVEC sono in grado di sintetizzare C3 e C7. Il secondo obiettivo della tesi è stato quello di esaminare la possibilità che il C7 sia presente sulla membrana delle EC ed agisca da accettore silente per i componenti complementari terminali attivati, garantendo alle EC una protezione contro un'eccessiva attivazione del sistema. Per valutare la presenza dei componenti C3 e C7 sulla membrana sono state applicate diverse tecniche comprendenti l 'ELISA, la microsopia a fluorescenza e quella elettronica a trasmissione. Inoltre, dopo aver dimostrato la presenza sulla membrana cellulare del C7 ma non del C3, abbiamo studiato i possibili ruoli funzionali di tale molecola, accertando una eventuale attività di "decoy acceptor" per gli altri componenti complementari. In particolare, si è valutato un possibile effetto protettivo sulle EC, svolto dal C7 di membrana, nei confronti del TCC solubile. Abbiamo studiato quindi come la formazione del complesso terminale sul C7 di membrana (mTCC) inibisca l'effetto proinfiammatorio svolto dal TCC solubile sulle EC, valutando l'espressione delle molecole di adesione, la produzione di IL-8 e l'aumento della permeabilità vascolare. Nella prima parte di questa tesi abbiamo dimostrato che sia l'iTCC sia il complesso presente in circolo, l'SC5b-9, inducono aumento della permeabilità vascolare, promuovendo la flogosi. L'attività permeabilizzante svolta dal TCC è mediata dal rilascio da parte delle EC di molecole vasoattive quali PAF e bradi chinina (BK). I risultati ottenuti utilizzando modelli "in vitro", sono stati confermati anche in un modello "in vivo" nel ratto. L' SCSb-9 induce la permeabilità vascolare provocando l'apertura delle giunzioni intercellulari. Abbiamo dimostrato, inoltre, che l'effetto vasopermeabilizzante provocato dal complesso terminale viene inibito dagli antagonisti dei recettori della BK di tipo B2 e del PAF. Nella seconda parte abbiamo valutato l'espressione dei componenti del C sulla membrana delle EC. Abbiamo dimostrato che il C7 è presente sulle EC isolate da vari distretti tissutali, e che è covalentemente legato alla membrana. L'espressione del C7 è modulata da diverse citochine e la molecola, simile a quella solubile, mantiene la capacità di legare gli altri componenti terminali formando il TCC sulla membrana cellulare (mTCC). Il C7 di membrana svolge una funzione di "decoy acceptor" per il TCC nascente, ed è in grado di inibire tutte le attività proinfiammatorie del complesso solubile, quali l'espressione delle molecole di adesione, la secrezione della IL-8 e l'aumento della permeabilità vascolare.
Insegnamento
Publisher
Università degli studi di Trieste
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