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Title: Ruolo dei citocromi P450 cerebrali nell’ossidazione della bilirubina: inducibilità ed attività
Other Titles: Role of brain Cytochrome P450 enzymes in bilirubin oxidation -specific induction and activity-
Authors: Gambaro, Sabrina Eliana
Supervisore/Tutore: Tiribelli, Claudio
Cosupervisore: Gazzin, Silvia
Issue Date: 28-Apr-2014
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: 
Abstract Hyperbilirubinemia is the most common clinical diagnosis during neona-
tal life. The neonatal jaundice may be physiological without any
clinical consequence, or can lead to an acute form of bilirubin en-
cephalopathy with minimal neurological damage, or to more severe
and dangerous condition called kernicterus (permanent neurological
sequelae).
The Gunn rat is one of the models in which bilirubin encephalopathy
was studied. It was shown that jaundiced newborn animals display
an hepatic compensatory mechanism for the incapacity to eliminate
bilirubin (Ugt1A1 mutant enzyme) by upregulation of cyotochrome
P450 enzymes (Cyp) 1A1 and 1A2 compared with their not jaun-
diced littermates. In addition, their expression in brain was selec-
tively induced (cortex higher and early vs. cerebellum lower and late
induction) by sudden increase of bilirubin content.
Cyotochrome P450 enzymes are the main enzymes involved in the
detoxification of drug and endogenous compounds. In liver their role
in bilirubin oxidation has been deeply demonstrated. In brain, there
are many works that analyzed Cyps expression and induction, but
their role in bilirubin oxidation has never been evaluated till now.
This thesis focused in; 1) analyze the inducibility of Cyps enzymes, by
a known inducer, βNF in cortex and cerebellum astrocytes; 2) Select
the optimal conditions to induce specifically each of them; 3) analyze
their activity and 4) evaluate their capacity to oxidize bilirubin; 5)
Last but not least, assess the protective effect of Cyps induction by
challenging the cells with high concentrations of bilirubin.We demonstrated that astrocytes Cyps were inducible (both mRNA
and activity) by βNF and this induction varies depending on the brain
region and among the Cyps. To explain the differences we hypoth-
esized the presence of: i) a different protein isoforms (discarded for
Cyp1A1) ii) different maturation stage of astrocytes in the two brain
regions (P2 rats: Cll is less developed than Cx), iii) differential regu-
latory mechanisms.
Our work showed that in Cx astrocytes Cyp1A1 induction (mRNA
and activity) was an early event (6h), requiring low concentration of
the drug, making this approach theoretically possible in vivo. On the
other hand, to reach the higher levels of Cyp1A1 (mRNA and activ-
ity) in Cll we needed 24h. In both cases Cyp1A1 was able to oxidize
bilirubin producing an increase in viability only after TCB addition.
The Cyp1A2 was the major catalyst of bilirubin degradation (with-
out the need of TCB), but its modulation was more difficult to be
achieved. In addition, while Cyp1A2 modulation increased bilirubin
oxidation in cortex (also reflected in an increment in viability), in
cerebellum we noticed a slight reduction in bilirubin clearance (no
improvements in viability). All this data could lead to the basis of
the cerebellum susceptibility to UCB. The observation that the TCB
addition in Cyp1A1 astrocytes increases bilirubin oxidation and via-
bility suggest the possibility to induce Cll resistance toward bilirubin
neurotoxicity by Cyps modulation and uncoupling. --------------------------------------------- Riassunto
Una delle condizioni neonatali pi`u comuni `e l’ittero. Esso rappresenta
l’aumento fisiologico della bilirubina nel sangue e tessuti. Tuttavia
esso pu`o divenire una condizione patologica (encefalopatia da biliru-
bina), caratterizzata da un danno neurologico minimo, o condurre a
una condizione severa e pericolosa per il neonato chiamata kernit-
tero (danni permanenti), in caso di una esposizione prolungata ad alti
livelli del pigmento. Attualmente, la patologia da iperbilirubinemia
rappresenta la principale causa di riammissione in ospedale nel primo
mese di vita.
Per il danno neurologico da bilirubina esiste un modello animale,
il ratto Gunn, che presenta la stessa mutazione genica dei pazienti
Crigler-Najjar I. Come nella condizione umana, esso manca della
uridin di fosfo glucuronisil tranferasi 1a1 (Ugt1A1), enzima epatico
deputato alla coniugazione della bilirubina. Tuttavia l’animale ri-
esce a compensare la mancanza mantenendo bassi i livelli serici di
bilirubina, grazie ad una incrementata attivit`a delle citocromo P450
mono-ossigenasi epatiche (Cyps, Cyp1A1 and Cyp1A2). Tali enzimi
riducono la concentrazione del pigmento attraverso la sua ossidazione.
`
E stato supposto che questo meccanismo possa essere alla base anche
della capacit`a di specifiche aree del cervello (cortex e collicoli superiori,
vs. i danneggiati cervelletto, ippocampo e collicoli inferiori) di ridurre
la concentrazione del pigmento, limitando/impedendo il danno neu-
rologico associato. Sebbene il loro ruolo, i meccanismi ed i prodotti
della loro attivit`a di clearance della bilirubina siano stati ampiamente
dimostrati in fegato, in cervello non sono ancora disponibili evidenze
funzionali della loro capacit`a di ossidare la bilirubina.
L’obiettivo di questa tesi `e stato di analizzare 1) la modulazione delle
Cyps cerebrali (brain Cyp: bCyp) utilizzando un noto induttore, βNF;
2) selezionare le condizione ottimali per una induzione selettiva di cias-
cuna bCyp; 3) allo scopo di valutare la loro attivit`a (EROD/MROD);4) e la capacit`a specifica di ossidare bilirubina; 5) conferendo pro-
tezione (aumento vitalit`a) alle culture primarie di astrociti (da cortex
e cervelletto) esposte a dosi tossiche di bilirubina.
Questo studio ha dimostrato la inducibilit`a delle bCyps (mRNA e
attivit`a) tramite βNF. Abbiamo evidenziato una modulazione dipen-
dente della regione cerebrale da cui sono state prodotte le cellule, in
aggiunta ad un comportamento differenziale delle Cyps tra loro. Pos-
sibili spiegazioni possono essere: i) la presenza di diverse isoforme tra
le regioni (ipotesi scartata in seguito ad analisi tramite western blot);
ii) diversa presenza delle vie di segnalazione alla base dei meccanismi
di modulazione, o, iii) una diversa risposta dovuta al diverso stadio
sviluppo degli astrociti preparati dalle due regioni (ratti P2: il Cll `e
meno sviluppato del Cx).
Inoltre, abbiamo documentato una precoce (6h) inducibilit`a della
Cyp1A1 nei astrociti dal Cx, che inoltre necessit`a di minori concen-
trazioni del principio. Tali caratteristiche suggeriscono che la Cyp1A1
sia pi`u facilmente modulabile in vivo. Tuttavia, per ottenere una
buona modulazione nel cervelletto (regione pi`u sensibile al danno),
bisogna mantenere la concentrazione dell’ induttore per un tempo
lungo (24h). In entrambe le regioni, un incremento significativo della
capacit`a di ossidare bilirubina, migliorando la vitalit`a delle cellule,
`e stato ottenuto solo dopo il co-trattamento con TCB (disaccoppia-
mento). La Cyp1A2 `e stata significativamente modulata solo negli
astrociti da Cx (24h), in cui abbiamo evidenziato un chiara capacit`a
dell’enzima di ossidare la bilirubina e migliorare la vitalit`a in assenza
di TCB. I risultati ottenuti permettono di comprendere la suscettibilit`a
differenziale (tra regioni del cervello) tipica di questa patologia. La
capacit`a di indurre Cyp1A1 e renderli pronti a ossidare la bilirubina
nei astrociti da Cll (regione pi`u danneggiata) e Cyp1A1/Cyp1A2 in
Cx e oltre migliorando la viabilit`a di questi suggeriscono la possibilit`a
di conferire resistenza a la tossicit`a da bilirubina.
Ciclo di dottorato: XXVI Ciclo
metadata.dc.subject.classification: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
Description: 
2012/2013
Keywords: Bilirubin encephalopathy
EROD
Bilirubin oxidation
Beta-naphthoflavone
Encefalopatia per bilirubina
MROD
Ossidazione della bilirubina
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: BIO/11 BIOLOGIA MOLECOLARE
NBN: urn:nbn:it:units-12538
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