Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/10118
Title: Protein quality control: from ribosome to proteasome.
Authors: Sasset, Linda
Keywords: 2A peptideRibosome StallingERADp97
Issue Date: 28-Apr-2014
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Il peptide 2A è un peptide virale di 18-23 aminoacidi presente in alcuni picornavirus, dei virus a RNA che codificano per una poliproteina che viene poi processata per produrre tutte le proteine virali. Il peptide 2A, in particolare, permette la divisione tra le proteine capsidiche e quelle replicative. Durante la traduzione il peptide 2A agisce come elemento autonomo, in grado di mediare il suo processamento al C-terminale: per farlo modifica l'attività del ribosoma, promuovendo l'idrolisi del legame estere tra il peptide nascente e il tRNA anziché che la formazione del legame peptidico, con il conseguente rilascio prematuro della proteina a monte e la continuazione della traduzione dalla Pro a valle. Abbiamo chiamato questa proprietà "terminazione non convenzionale della traduzione", per distinguerla dalla terminazione convenzionale che si verifica in presenza di un codone di STOP e che viene mediata dai fattori di rilascio 1 e 3. Per questa sua attività, sia degli aminoacidi Asn-Pro-Gly al C-terminale del peptide 2A che la Pro al N-terminale della proteina a valle sono essenziali. Grazie alla sua capacità di autoprocessamento, il peptide 2A può essere utilizzato per produrre due proteine da un unico open reading frame (ORF) . Nella prima parte del lavoro abbiamo testato due differenti peptidi 2A (uno derivante dal Foot-and-Mouth Disease Virus (F2A), e uno dal Porcine Teschovirus (T2A) per trovare eventuali differenze tra la loro attività in termini di terminazione non convenzionale e di reinizio della traduzione dalla Pro a valle. Entrambi questi peptidi si sono mostrati molto efficienti nella terminazione non convenzionale, come si nota dalla quasi totale assenza di proteina di fusione. Tuttavia, il reinizio della traduzione dalla Pro valle 2A non è completo, come si evince dal fatto che la proteina a valle viene prodotta in una quantità inferiore rispetto a quella a monte. Abbiamo determinato che F2A funziona meglio T2A, in quanto consentee la sintesi della proteina a valle con maggiore efficienza. Questi risultati indicano che il peptide F2A è un ottimo sistema per la co-espressione di proteine in vivo. Abbiamo sfruttato questa tecnologia per la produzione di anticorpi ricombinante, riuscendo a produrre sia in vitro che in vivo la catena leggera e pesante dell’anticorpo, che inoltre si assembla correttamente. Nella seconda parte del lavoro abbiamo studiato una caratteristica particolare del peptide 2A: quando viene posizionato immediatamente a monte di un codone di stop, l'espressione della proteina a monte è fortemente compromessa. Questa caratteristica è dovuta alla sequenza amminoacidica, e non a quella nucleotidica. La causa di questa compromissione dell’espressione risiede in un forte stalling del ribosoma al sito Gly-STOP, totalmente dipendente dagli ultimi tredici residui del peptide 2A e dalla presenza degli amminoacidi C-terminali Asn-Pro-Gly terminali. Come conseguenza del blocco, viene attivato un controllo di qualità a livello del ribosoma, che induce l’ubiquitinazione e la degradazione da parte del proteasoma della piccola quantità di proteina prodotta. Questa attività di controllo da parte del peptide 2A sulla traduzione è efficace sia su ribosomi legati alla membrana dell’ER, che su quelli liberi nel citosol. Per i ribosomi legati alla membrana, abbiamo identificato il coinvolgimento di alcuni membri del pathway di retrotraslocazione come l’AAA ATPasi p97 e la deubiquitinase YOD1, suggerendo un meccanismo di controllo di qualità che rileva la presenza di ribosomi in stallo sul lato citosolico della membrana dell’ER e la segnala ad effettori presenti nel lato luminale per indurre la degradazione associata all’ER (ERAD) dei peptidi nascenti. E’ noto che uno dei principali mediatori dell’ERAD è l'AAA ATPasi p97/VCP; si che p97 sia necessaria per la retrotraslocazione e la degradazione da parte del proteasoma dei substrati ERAD, e che la sua perdita provoca la loro ritenzione nel lume dell’ER. Di conseguenza, l’attività ATPasica di p97 è ritenuta essenziale per l'estrazione delle proteine dalla membrana dell’ER . Per studiare il ruolo di p97 in ERAD, abbiamo usato un metodo recentemente sviluppato nel nostro laboratorio (Petris et al., 2011) che consiste nella mono-biotinilazione in vivo, da parte della biotin ligasi citosolica Bira, di substrati proteici taggati con il Biotin Acceptor Peptide BAP (GLNDIFEAQKIEWH). Questo metodo consente una discriminazione precisa tra le proteine che si trovano nel lume dell’ER (non biotinilate) e nel citoplasma (biotinilate). Abbiamo analizzato l'effetto di: 1) una forma dominante negativa di p97 (p97QQ), 2) un siRNA specifico per p97, e 3) l’inibitore chimico di p97 DBeQ, in tre diversi substrati modello di ERAD: NS1, il mutante Null Hong Kong dell’α1-antitripsina (NHK-α1AT), e Tetherin. I nostri risultati sono in contrasto con la visione predominante di p97 come fornitore di energia per l'estrazione delle proteine dall’ER in maniera ATP-dipendente. Abbiamo trovato che l'attività di p97 non è coinvolta nella retrotraslocazione di queste proteine, ma piuttosto nella separazione delle proteine, già nel lato citosolico, e nel reclutamento della PNGase. Risultati simili sono stati ottenuti analizzando l'effetto di una forma dominante negativa della deubiquitinase p97-associata YOD1 (YOD1 C160S).
The 2A peptide is a short viral peptide of 18-23 amino acids, present in some picornaviruses. These RNA viruses encode a polyprotein that is late-processed to produce all viral proteins. 2A allows the primary cleavage between the capsidic and the replicative proteins. It works as an autonomous element during translation, capable of mediating self-processing at its C-terminus. It modifies the ribosome activity, promoting hydrolysis of the ester bond between the nascent peptide and the tRNA rather than the formation of the peptide linkage, resulting in a premature release of the upstream protein and continuation of translation from the in-frame downstream Pro codon. We call this property “non-conventional translation termination”, in contrast to the “conventional translation termination” occurring at a STOP codon site and mediated by the Release Factors 1 and 3. For its activity both the amino acids Asn-Pro-Gly at the C-terminus of the 2A peptide, and the Pro at the N-terminus of the downstream protein are essential. Due to its property of self-processing at the C-terminus, in mammalian cells it can be used to produce two proteins from a single open reading frame (ORF). In the first part of the work we tested two different 2A peptides (one derived from the Foot-and-Mouth Disease Virus (F2A) and one from the Porcine Teschovirus (T2A)) in order to see possible differences between their activity in term of non-conventional translation termination and re-initiation of translation from the 2A downstream Pro. We found that both these peptides were very efficient in terminating translation, in fact we observed only a very little amount of fusion protein. However, re-initiation from the 2A downstream Pro was not complete, in fact we observed that the downstream protein was produced in a lower amount than the upstream one. We also determined that F2A worked better than T2A, allowing synthesis of the downstream protein with higher efficiency. These results indicate that F2A peptide is a powerful system for the co-expression of proteins in vivo. We exploited this technology for the production of recombinant antibodies. We found that both in vitro and in vivo antibody’s light and heavy chains were produced, and the complete antibody was properly folded. In the second part of the work we investigated a particular feature of the 2A peptide: when it was positioned immediately upstream of a STOP-codon, expression of the upstream protein was heavily impaired. We found that the compromised expression was due to the amino acidic and not to the nucleotidic sequence of the peptide. We found also that it was a consequence of a strong ribosome stalling at the Gly-STOP-codon boundary, totally dependent on the last thirteen 2A residues and on the presence of Asn-Pro-Gly as C-terminal amino acids. As a consequence of the stalling, a ribosome-mediated quality control is activated, inducing ubiquitination and proteasome degradation of the small amount of protein produced. This 2A regulatory activity on translation was effective on both membrane-bound and free ribosomes. We found that, for membrane-bound ribosomes, members of the retrotranslocation pathway such as the AAA-ATPase p97 and the deubiquitinase YOD1 were involved, thus suggesting a quality control mechanism that senses the presence of stalled ribosomes on the ER membrane cytosolic side and signals to effectors present in the luminal side to induce ERAD (Endoplasmic Reticulum Associated Degradation). It is widely known that one of the main players in ER Associated Degradation is the AAA-ATPase p97/VCP. It is generally thought that p97 ATPase activity is required for retro-translocation and proteasomal degradation, and that its loss causes retention of ERAD substrates in the ER lumen. As a consequence, p97 ATPase activity is considered essential for extraction of proteins from the ER membranes. To study the role of p97 in ERAD, we used a method recently developed in our laboratory (Petris et al., 2011), which is based in the specific in vivo mono-biotinylation by the cytosolic biotin ligase BirA of protein substrates tagged with the 15 amino acids-long Biotin Acceptor Peptide BAP (GLNDIFEAQKIEWH). This method allows a precise discrimination between the proteins located in the Endoplasmic Reticulum (non biotinylated) or in the cytoplasm (biotinylated). We analysed the effect of: 1) a dominant negative form of p97 (p97QQ), 2) a p97 specific siRNA, and 3) the p97 chemical inhibitor DBeQ, on the three different ERAD model substrates NS1, Null Hong Kong mutant of α1 anti-trypsin (NHK-α1AT), and Tetherin. Our results clearly challenge the predominant view of p97 as energy provider for the extraction of unfolded proteins from a putative retrotranslocon in an ATP-dependent manner. We found that p97 activity is not involved in the retrotranslocation of these proteins from ER to cytosol, but rather in the segregation of proteins already in the cytosolic side and in the recruitment of PNGase. Similar results were obtained analysing the effect of a dominant negative form of the p97-associated deubiquitinase YOD1 (YOD1 C160S).
Description: 2012/2013
URI: http://hdl.handle.net/10077/10118
NBN: urn:nbn:it:units-12540
Appears in Collections:Scienze biologiche

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Sasset_phd.pdfTesi Ph.D.15.55 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record


CORE Recommender

Page view(s)

977
checked on Feb 23, 2018

Download(s)

629
checked on Feb 23, 2018

Google ScholarTM

Check


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons