Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/10154
Title: Electrophysiological and Morphological Characterization of Potentiated Synapses at the Micro and Nanoscale
Authors: Rauti, Rossana
Keywords: Synaptic plasticityBDNFHippocampal culturesElectrophysiological recordingsLTP
Issue Date: 11-Apr-2014
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Col termine generale di “plasticità sinaptica” si intendono tutti i meccanismi che stanno alla base della capacità del sistema nervoso di plasmarsi a seguito della sua maturazione e a fronte di stimoli esterni. Variazioni nella forma e nelle dimensioni oltre che l’instaurazione di nuove sinapsi o l’eliminazione di altre (sinaptogenesi) sono i meccanismi che regolano la plasticità sinaptica. Il sistema nervoso centrale è in grado di mettere in atto fenomeni di plasticità sinaptica in grado di modificarne la struttura e la funzionalità sia a corto che a lungo termine. Uno dei più studiati meccanismi cellulari alla base della memoria e dell’apprendimento è il potenziamento a lungo termine (Long Term Potentiation – LTP), una forma di plasticità neuronale che porta a un incremento dell’efficienza della trasmissione sinaptica durevole nel tempo. A livello cellulare, l’LTP aumenta la capacità di due neuroni di comunicare attraverso le sinapsi. Il meccanismo molecolare alla base di tale aumento dell’efficienza della trasmissione sinaptica non è univocamente stabilito, questo in parte è dovuto al fatto che l’LTP è determinato da diversi meccanismi che variano in base alla specie e alla regione del cervello in cui viene indotto. Una volta innescato, l’LTP conduce a varie modificazioni postsinaptiche, tra cui sintesi di nuovi recettori, nascita di nuove sinapsi (in particolare a livello del recettore glutamatergico NMDA) e cambiamenti a livello delle spine dendritiche (Engert and Bonhoeffer, 1999). Ragionevolmente, per indurre potenziamento a lungo termine è necessario che la membrana postsinaptica sia depolarizzata nell’intervallo di tempo in cui il terminale presinaptico libera glutammato: la depolarizzazione rimuove il blocco degli ioni magnesio dai recettori NMDA consentendo il passaggio (oltre al sodio e al potassio) anche agli ioni calcio. Il calcio è l'elemento centrale del processo perché, una volta raggiunta una certa concentrazione nella cellula, è in grado di attivare un processo per cui i recettori AMPA presenti nella cellula vengono trasferiti sulla membrana e i recettori già presenti lasciano passare una maggiore quantità di ioni. La sinapsi risulta così rinforzata. Questa condizione è stata sperimentalmente dimostrata su campioni di fettine di ippocampo usando una stimolazione elettrica (tetanica) (Nishi et al., 2001). Dopo la stimolazione tetanica, il neurone bersaglio rafforzato dall’LTP è molto più responsivo e produce un aumento dell’ampiezza delle correnti eccitatorie post-sinaptiche (Excitatory Post Synaptic Currents – EPSC) che perdura nel tempo. Questo comportamento trova spiegazione in una modificazione delle spine dendritiche sia nella forma, sia nel numero e dimensione. L’attività del mio dottorato di ricerca è stata condotta nell’ambito del progetto NanoMosquito, il cui scopo prinicipale consiste nell’indurre fenomeni di plasticità neuronale in cellule dissociate d’ippocampo di ratto e, successivamente, nel caratterizzare le mutazioni funzionali (tramite la tecnica elettrofisiologica del patch-clamping) e morfologiche, in scala micro e nanometrica, utilizzando tecniche quali la microscopia confocale e la microscopia a forza atomica (Atomic Force Microscopy – AFM). Diverse stimolazioni sono state testate per carcare di capire quali potessero indurre potenziamento della rete. Studi di plasticità vengono condotti in genere su fettine organotipiche, ma queste rendono impossibile studiare i cambiamenti che avvengono a livello delle spine dendritiche con tecniche in scala nanometrica, quali l’AFM. Diversi protocolli di stimolazione (treni a bassa frequenza, theta burst) sono stati utilizzati in esperimenti a doppio patch (due elettrodi usati in simultanea) su due cellule neuronali vicinali. Questo tipo di stimolazione ha portato però solo a un numero limitato di sinapsi potenziate e per questo motive abbiamo deciso di uitlizzare una particolare forma di plasticità sinaptica che prende il nome di Spike-Timing Dependent Plasticity (STDP). In questo tipo di plasticità il preciso ordine temporale tra i potenziali d’azione presinaptici e postsinaptici determina i cambiamenti che avverrano a livello della sinapsi stessa; per ottenere un potenziamento a livello del contatto sinaptico, il potenziale d’azione a livello postsinaptico deve seguire la depolarizzazione a livello presinaptico in una finestra temporale che va dai 5 ai 20 millisecondi (Bi and Poo, 1998). Anche in questo caso, monitorando successivamente l’ampiezza delle EPSCs, solo poche sinpasi andavano incontro a plasticità e il meccanismo che sta alla base di questo deve essere ancora determinato. Al contrario, il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), membro della famiglia delle neurotrofine e abbondantemente espresso nel sistema nervoso centrale (SNC), sta emergendo come un importante mediatore nella sopravvivenza, sviluppo e funzione dei neuroni (Lu, 2003). Colture embrionali dissociate di ippocampo sono state per la prima volta trattate cronicamente con BDNF promuovendo la formazione di nuove sinapsi, sia a livello eccitatorio che inibitorio, con conseguente aumento dell’attività spontanea dell’intera rete. Il BDNF inoltre si pensa induca modificazioni morfologiche sia nella complessità dell’albero dendritico che nel promuovere la crescita delle terminazioni assonali (Vicario-Abejon et al., 1998). Registrazioni elettrofisiologiche sono state effettuate per monitare l’attività spontanea della rete: nel dettaglio sono state misurate le EPSC e le IPSC tra neuroni incubati in BDNF e campioni di controllo mentre registrazioni doppie sono state effettuate per confrontare la percentuale di accoppiamento. Abbiamo così visto come il BDNF rafforzi l’attività sinaptica della rete e aumenti il numero di connessioni sinaptiche eccitatorie. Registrazioni paired-pulse ed esperimenti di imaging con FM1-43 hanno invece dimostrato come il BDNF induca anche delle modificazioni nella probabilità di rilascio vescicolare, in quanto, anche in questo caso l’ampiezza della risposta risulta aumentata nelle colture incubate. Marcando i neruoni (β-tubulin III) abbiamo visto anche come il BDNF aumenti la sopravvivenza neuronale, sopratutto a carico delle cellule piramidali, riconosciute dalla loro forma. Inoltre, eseprimenti condottti su cellule transfettate con cds-BDNF hanno confermato ulteriormente i nostril dati su come il BDNF aumenti la trasmissione sinpatica. La caratteristica comune di tutti questi diversi approcci è stata quella di indurre modifiche funzionali nelle connessioni sinaptiche eccitatorie. Successivamente l'induzione della plasticità sinaptica, la microscopia a scansione sarà utilizzata per seguire in tempo reale i cambiamenti morfologici delle sinapsi.
The brain is programmed to drive behaviour by exactly wiring the appropriate neuronal circuits. Wiring and rewiring of neuronal circuits widely depends on the orchestrated changes in the strengths of synaptic contacts. For many years, neuroscientists believed that neurogenesis - the generation of new neurons – and establishment of new neuronal connections was restricted to early brain development (Segal et al, 2005). New findings have challenged this view and currently many neuroscientists believe that the capacity for circuitry rearrangement is maintained throughout life. However the mechanisms that controls plasticity in the adult brain are still not entirely clear. The connection between neurons is named synapse. The synapse is the most fundamental unit of information transmission in the nervous system. Information storage, including all forms of memory and behavioural adaptation, are believed to come out from changes in neuronal transmission, both in the short-term and the long-term, a property known as synaptic plasticity. Synaptic plasticity is a highly regulated process, refers to all the mechanisms that underlie the ability of the nervous system to adapt to external stimuli. Variations in the shape and size as well as establishment of new synapses or the elimination of others (synaptogenesis) are the mechanisms that regulate synaptic plasticity. Thus, understanding the mechanisms underlying synaptic plasticity may help to apprehend general learning and memory processes. Changes in synaptic plasticity are achieved by changes in inhibitory or excitatory neurotransmission or both. This thesis deals with the modulation of excitatory neurotransmission. The principal excitatory neurotransmitter in the brain is glutamate. The regulation of glutamate-mediated excitatory neurotransmission has been shown to play a critical role in many aspects of synaptic plasticity. One of the most studied cellular mechanisms is the long-term potentiation (LTP), a form of synaptic plasticity that leads to an increase in the efficiency of synaptic transmission (Engert et al., 1999). The induction of LTP is classically achieved by tetanic stimulation but it is also possible to induce chemically a long-term potentiation of the synaptic efficacy, thus enhancing a larger number of synapses compared to electrical stimulation. The work of this thesis has been conducted in the wider framework of the NanoMosquito project, whose major aim was to combine electrophysiological measurements, scanning probe microscopy (AFM-Atomic Force Microscopy) and fluorescence microscopy in order to develop new generation neurophysiological tool to understand neuronal plasticity at the nanoscale. Studies of synaptic plasticity are often carried out in slices of hippocampus, but these prevent to study change in nanoscale with a surface-microscopy technique such is AFM: dissociated hippocampal neurons lend themselves well for this purpose. Understanding in detail the mechanism of action of these processes may be of critical importance not only for a detailed view of memory related processes but also in the case of some diseases: being able to control synaptic plasticity may help to restore a functional connectivity lost, for example, in the case of brain lesions. The first part of this thesis handles the setting of an electrophysiological stimulation to induce neuronal plasticity, starting from the stimulations trains usually performed in hippocampal slices, such as slow frequency stimulation and theta burst. Long-term synaptic modifications can be induced also by a particular form of synaptic plasticity named Spike-Timing Dependent Plasticity (STDP) where the precise timing and the order of presynaptic and postsynaptic action potentials determine the magnitude and the direction of the changes in synaptic strength (Bi and Poo, 1998). I have tested trains of with a delay of 5, 10 and 20 milliseconds between pre- and postsynaptic neuron. By monitoring the amplitude and frequency of the EPSCs, responses varied from no changes to potentiation but just in a small sample of coupled neurons where we measured a strong increase in the amplitude and frequency of spontaneous EPSCs after the stimulation. The cellular basis that gives rise to the induction of such synaptic modifications remains to be determined. On the other hand, BDNF ability to mediate activity-dependent modifications in synaptic strength (Bolton et al., 2000; Vicario-Abejón et al., 1998) has recently received considerable attention; in particular the acute BDNF effects on excitatory synapses have been the object of an increasing amount of studies. On the contrary, the role of BDNF in regulating long-lasting changes in synaptic function is comparably less investigated and may have large impact on post injury alteration of synaptic networks and neuronal rescue. To address this issue, during my PhD, I studied the long-term (chronic) effects of BDNF on AMPA receptor mediated excitatory synaptic transmission and on neuronal survival in vitro. Dissociated rat (P2-P3) hippocampal cultures were chronically treated (4 days) with BDNF between 4 and 8 days in vitro (DIV). Single and dual patch-clamp recordings in whole-cell configuration were used to monitor spontaneous and evoked post synaptic currents (IPSCs and EPSCs) in hippocampal network grown in culture for 8-10 DIV. Excitatory PSCs (EPSC) were identified by their kinetic (fast decay τ) and pharmacology (CNQX sensitivity). EPSCs recorded from BDNF-treated cultures show a strong increase in their mean frequency and amplitude when compared to controls untreated sister cultures. In the presence of TTX, miniature excitatory PSCs (mEPSCs) in BDNF treated networks still displayed an increase in both frequency and amplitude. In BDNF-treated cultures pair recordings showed an increased probability of finding coupled pairs. Paired pulse (20 Hz) experiments and FM1-43 fluorescence imaging suggested that BDNF treatment increased the probability of release. Immunofluorescence (β-tubulin III) visualization of neurons allowed to quantify neuronal density and showed that BDNF mediated an increase (40%) in neuronal survival, when compared to controls, together with an increase in the pyramidal neuron/interneuron ratio (0.33 for BDNF, 0.19 for controls). Additionally, neuronal cells were transfected with different BDNF-GFP expressing vectors to gain insights in the specific molecular mechanisms involved in long term BDNF effects on synapses. However the common feature of all these functional modifications is in the direction of a pronounced potentiation of excitatory synaptic connections. Subsequently to the induction of synaptic plasticity, scanning probe microscopy would be used to follow in real time morphological changes of synapses undergoing potentiation or neuronal processes development with submicrometrical resolution in all 3 dimensions. Final goal of the entire project, whereof this thesis is the fundamental initial step, will be the development of new paradigms to evaluate and induce synaptic plasticity on specific synapses to govern in a controlled way neuronal outgrowth and synaptogenesis.
Description: 2012/2013
URI: http://hdl.handle.net/10077/10154
NBN: urn:nbn:it:units-12581
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