Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/10381
Title: Insights into structural features that affect the biological activities and mode of action of the human antimicrobial cathelicidin LL-37
Other Titles: Caratterizzazione degli aspetti strutturali che determinano le attività biologiche della catelicidina antimicrobica dell'uomo LL-37
Authors: Xhindoli, Daniela
Keywords: AMPsLL-37photo-crosslinkingdimerizationcytotoxicityRL-37oligomerizationcathelicidinp-cyano-phenylalanine
Issue Date: 28-Apr-2014
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: The human peptide LL-37 is an important innate immune effector that contributes to defending the organism against infection in different scenarios, ranging from direct bacterial killing to the modulation of immune responses and acting as a signal molecule for different cell types involved in defence or healing. All these functions are possible despite its relatively simple structure, due to its capacity to interact with different types of biological membranes. This cationic peptide is able to switch from a random coil in aqueous solutions into an amphipathic helical structure in presence of salt ions or in the presence of membranes. Intra- and inter-molecular hydrophobic interactions in the hydrophobic sector of the amphipathic helix, together with ionic interactions in the polar sector, make LL-37 prone to self-association, which strongly affects its multiple biological roles, and these therefore need to be explored in detail. In this thesis I have investigated how folding occurs when LL-37 passes from bulk solution to the surface of membranes, and which structural features could be relevant for its in vitro antimicrobial and host cell modulating activities. For this reason comparative biophysical studies were performed on LL-37 and its structurally diverse orthologue in macaque, RL-37. Fluorescent analogues of LL-37 and RL-37, obtained from the systematic substitution of Phe residues with the non-invasive fluorescent probe, p-cyanophenylalanine, contributed to elucidate differential conformational variations in these peptides. Steady-state and time-resolved fluorescence studies confirmed that unlike RL-37, which is monomeric in physiological solution or in presence of neutral model membranes, LL-37 is in an oligomeric form in solution, with a hydrophobic core likely forming near the central region. Furthermore LL-37 appears to interact with both anionic and neutral membranes in an oligomeric form. Cytofluorimetric studies, performed on bacterial cells treated at toxic peptide concentrations, confirmed that the different conformations of LL- and RL-37 in solution give rise to quite different modes of bacterial permeabilization. Lesions of a larger size were observed for LL-37, consistent with a toroidal pore-forming mechanism, while smaller lesions were detected for RL-37 and may indicate an incipient detergent-like mechanism of bacterial inactivation. I further investigated how many molecules are involved in the self-associated form of LL-37, either in solution or in presence of membranes, replacing the Phe5 residue with an analogue bearing Benzoyl-phenylalanine on the side-chain, which is able to crosslink to adjacent molecules when irradiated with UV light. Photo-crosslinking studies revealed that LL-37 is in equilibrium between forms ranging from monomeric to hexameric in physiological solution, and dissociates to lower order oligomers in the presence of membranes, but does not become completely monomeric. The effects of oligomerization on the biological activities of LL-37 were further explored through testing its antiparallel and parallel covalently bound dimers, linked at either end, designed to mimic an obligatory dimeric form of the peptide. Both types of dimerization reduced the antibacterial potency of LL-37 and its capacity to permeabilize the bacterial membrane. Cytotoxic effect against the host cells was instead different for the three forms of dimers tested, and was related to the degree of freedom of the C- or N-terminal region. From the information obtained on the role of oligomerization on the antibacterial and cytotoxic activity of LL-37, I then rationally designed four different analogues of LL-37, which bear minimal primary structure alterations from the native peptide, such as the replacement of one, or exchange of two adjacent residues, in order to modify inter- and intra-molecular salt-bridging. I attempted in this way to transfer some of the RL-37 characteristics to LL-37 in order to improve its antimicrobial properties through reducing its propensity to self-assemble. I confirmed that variations in the equilibrium between attractions or repulsions in LL-37 significantly affect its antibacterial activity and mode of action.
Il peptide antimicrobico dell’uomo LL-37 è un componente importante del sistema immunitario che contribuisce a difendere l’organismo dalle infezioni, per via di diversi meccanismi, che possono variare dall'azione diretta battericida, alla modulazione della risposta immunitaria, agendo da molecola segnale per diversi tipi di cellule coinvolte nella difesa oppure nella guarigione dell'organismo ospite. Tutte queste attività sono dovute alla sua struttura relativamente semplice, ma capace di interagire con diversi tipi di membrane biologiche. Questo peptide carico positivamente è in grado di assumere una conformazione elicoidale in presenza di soluzioni saline oppure in presenza delle membrane. La presenza di interazioni idrofobiche, inter- e intra-molecolari, nel settore idrofobico dell’elica amfipatica insieme alle forze ioniche presenti nella regione polare causano aggregazione di LL-37. Questa caratteristica a sua volta influenza fortemente le diverse attività biologiche di LL-37 e perciò è un aspetto importante che necessita di essere studiato in modo approfondito. In questa tesi io ho investigato come avviene la strutturazione del peptide quando esso passa dalla soluzione alla superficie della membrana, e quali sono gli aspetti strutturali rilevante per l'attività antimicrobica in vitro e per la modulazione della risposta delle cellule dell’ospite. Per questo motivo sono stati usati vari metodi biofisici per confrontare la struttura di LL-37 con il suo ortologo nella scimmia RL-37. Sostituendo un residuo di fenilalanina con la sonda fluorescente non invasiva p-cyano-fenilalanina è stato possibile ottenere vari analoghi fluorescenti dei due peptide nativi, disegnati per ottenere maggior informazione a riguardo le variazioni conformazionali e per investigare il meccanismo d’azione di LL- e RL-37. Gli studi con gli analoghi fluorescenti hanno confermato che diversamente da RL-37, che è monomerico in soluzioni fisiologiche o in presenza di membrane neutre, LL-37 forma un oligomero in soluzione, con un nucleo idrofobico attorno alla regione centrale dell’elica. Inoltre, LL-37 interagisce con le membrane sia cariche positivamente che neutre nella forma oligomerica. Dagli studi fatti con il cyto-fluorimetro, trattando le cellule batteriche con concentrazioni tossiche di peptide, si è notato che i due peptidi con conformazione diversa in soluzione interagiscono e permeabilizzano le membrane in modo diverso. Le lesioni causate nei batteri dopo il trattamento con LL-37 erano regolari e di dimensioni tali da suggerire un meccanismo battericida per via di formazione dei pori di membrana, invece RL-37 causa danni di piccole dimensioni alla membrana batterica, compatibile con un meccanismo d’azione simile a quello di un detergente. Inoltre io ho indagato sul numero di molecole che partecipano alla formazione della forma oligomerica di LL-37, sia in soluzione che in presenza delle membrane. Questo è stato possible tramite la sostituzione di Phe5 con un residuo analogo benzoyl-fenilalanina, il quale permette di legare covalentemente molecole adiacenti, quando viene irradiato con raggi UV. Questi studi hanno dimostrato che LL-37 è in equilibrio tra la forma monomerica ed oligmerica, con estensione fino ad esamero in soluzioni fisiologiche, per poi dissociarsi a forme inferiori oligomeriche in presenza delle membrane. Gli effetti dell’oligomerizzazione del peptide LL-37 sulle sue attività biologiche sono stati ulteriormente investigati tramite lo studio svolto con i dimeri covalenti di LL-37, legati con un ponte di solfuro nella regione C-terminale oppure N-terminale. Questi dimeri, paralleli o antiparalelli sono stati ideati per mimare la fomra oligomerica di LL-37. Entrambi i tipi di dimerizzazione hanno mostrato che l’aggregazione di LL-37 porta ad una riduzione dell’attività antimicrobica e dell’efficienza del peptide a permeabilizzare le membrane batteriche. Invece la cito-tossicità verso le cellule dell’ospite è diversa per tutte e tre forme dimeriche ed è legata al grado di libertà della regione N-terminale del peptide. Date le informazioni ottenute sul ruolo dell’oligomerizzazione sull'attività antibatterica e citotossica di LL-37, io ho disegnato 4 analoghi di LL-37 ottenuti da una minima alterazione della struttura primaria rispetto al peptide nativo, come per esempio lo scambio della posizione di uno o più residui adiacenti in modo da alterare la rete di ponti saline tra le molecole e interamente la struttura del peptide. In questo modo si è voluto attribuire alcune caratteristiche di RL-37 al peptide dell’uomo LL-37, in modo da modificare la sua propensione ad assemblarsi per formare oligomeri. Con questi studi si è confermato che variazioni nel equilibrio delle forze attrattive o repulsive nella catena di LL-37 possono alterare significativamente la sua attività antibatterica e il modo d’azione.
Description: 2012/2013
URI: http://hdl.handle.net/10077/10381
NBN: urn:nbn:it:units-13280
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