Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/10901
Title: Glucose coated nanoparticles for mesenchymal cancer cells recognition
Other Titles: Glucose Coated Nanoparticles for Mesenchymal Cancer Cells Recognition
Authors: Venturelli, Leonardo
Supervisore/Tutore: Cojoc, Danut Adrian
Scoles, Giacinto
Issue Date: 23-Mar-2015
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Lo scopo del presente progetto di Dottorato riguarda la possibilità di riconoscere ed identificare le cellule mesenchimali del cancro sfruttando il metabolismo iper-attivato, nonché de-regolato, delle stesse. Una delle differenze principali tra le cellule epiteliali e quelle mesenchimali, del cancro, è il metabolismo ed in particolare il così detto Effetto Warburg (da Otto Einrich Warburg il suo scopritore e sostenitore, nel 1926). Nello specifico, questo effetto riguarda la caratteristica delle cellule tumorali di preferire, come via metabolica, la glicolisi alla classica fosforilazione ossidativa, anche in presenza di ossigeno. Questo processo, infatti, porta a produzione ed accumulo di acido lattico e ad una riduzione della quantità disponibile di glucosio nel mezzo esterno. Negli ultimi anni si è scoperto quanti e quali vantaggi competitivi, dal punto di vista proliferativo, comporti questa trasformazione, consentendo così anche lo sviluppo di numerose tecniche terapeutiche e diagnostiche basate proprio sulla trasformazione della fisiologica normalità. Questo progetto di dottorato si è proposto di sviluppare una nuova metodica diagnostica in grado di distinguere le cellule mesenchimali del cancro da quelle epiteliali tramite lo studio del loro metabolismo e senza l’ausilio di anticorpi. Essendosi prefisso, infatti, come scopo finale quello di fornire un contributo nel campo della diagnosi preventiva e della prognosi a basso costo; una degli intenzioni principali del presente progetto era quello di ridurre al minimo l’utilizzo di anticorpi nel processo di identificazione dei due sottotipi tumorali. Questo progetto ha così sviluppato un sistema basato su nanoparticelle magnetiche (MNPs), in particolare di cobalto ferrite, con lo scopo di favorire l’ avanzamento nel campo delle attuali tecniche di isolamento magnetico. Nello specifico le MNPs sono state sintetizzate e funzionalizzate con un analogo fluorescente del glucosio (il 2-2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose, 2-NBDG) e caratterizzate con spettroscopia infrarossa e microscopia elettronica. Al fine di poterne monitorare in vitro la captazione da parte delle cellule tumorali, sono state utilizzate due ben note linee cellulari di tumore alla mammella, le MCF7 e le MDA-MB-231, definite rispettivamente: epithelial-like e mesenchymal-like. Ne è stata valutata la captazione e quindi l’internalizzazione da parte di queste due linee di cancro al seno, dimostrandola con 3 differenti metodiche (microscopia confocale, saggio di immuno-cito-chimica e analisi con microscopia elettronica accoppiata a milling ionico micro-guidato). In particolare è stato dimostrato come aumentando la concentrazione di glucosio nel mezzo (da 5.5 a 25 mM), le cellule epiteliali riducano drasticamente l’uptake di MNPs mentre esso si conservi nel sottotipo mesenchimale. Tale differente comportamento è infatti basato sul differente metabolismo dei due sottotipi tumorali, il quale consente, senza l’utilizzo di anticorpi, di individuare il sottotipo mesenchimale, più metabolicamente attivo (e tipicamente più aggressivo), da quello epiteliale. Successivamente è stato ricercato il meccanismo molecolare responsabile di tale internalizzazione tramite l’inibizione del più espresso trasportatore di membrana del glucosio, Glut1, con un inibitore selettivo (STF-31). La specifica captazione da parte delle cellule mesenchymal-like è stata infine studiata come potenziale caratteristica da sfruttare per eventuali trattamenti di ipertermia, o termoterapia. Nello specifico è stato utilizzato un laser infrarosso che focalizzato in maniera accurata e precisa su uno degli aggregati di MNPs (dimensionalmente compatibile con la risoluzione della microscopia ottica), presenti all’interno delle cellule, ne ha permesso l’induzione selettiva di morte (necrosi o apoptosi in base tipicamente al tempo e all’intensità dell’esposizione). La possibilità di indurre una morte selettiva nelle cellule tramite la somministrazione di nanoparticelle magnetiche, è attualmente ben nota sia in ricerca che in terapia, ma esclusivamente tramite l’ausilio di campi magnetici oscillanti, onde radio o raggi infrarossi non focalizzati. Infine per le applicazioni diagnostiche, che questo progetto si era prefissato, è stato studiato e sviluppato un dispositivo microfluidico utile all’isolamento di cellule tumorali tramite il principio di displacement magnetico. Tale dispositivo è stato studiato tramite simulazioni a computer ed in seguito prodotto per i successivi test. Ne sono stati valutati i parametri fondamentali ed infine studiato sperimentalmente con biglie magnetiche di dimensioni comparabili alle cellule, riportando infine i calcoli teorici per l’applicazione su campioni contenenti cellule tumorali. Le dimostrazioni applicative che questa tesi di Dottorato ha fornito potranno portare, nel prossimo futuro, ad un avanzamento nel campo della diagnostica del cancro, consentendo di sviluppare sistemi a basso costo e quindi check-up più frequenti e mirati. Infine le prove di ipertermia eseguite, sfruttando le nanoparticelle magnetiche, forniscono interessanti spunti per possibili nuove terapie mirate.
In cancer diagnosis the recognition of epithelial and mesenchymal cancer cells is one of the most difficult challenges. The former subtype have a well recognized method for their identification that uses an anti Epithelial Cell Adhesion Molecule (Ep-CAM) antibody. In contrast, the mesenchymal subtype lacks of a well spread and well expressed membrane marker lowering, consequently, the possibilities to develop a widely-usable assay. Currently, the proposed methods and techniques use several specific antibodies to recognize and isolate the mesenchymal cancer cells from whole blood. In this Doctorate thesis we exploit the possibility to use metabolism instead of membrane markers to recognize and isolate mesenchymal cancer cell from a complex environment like the one in the presence of cells with other subtype characteristics. The metabolism of cancer cells is characterized by a higher rate of glycolysis respect to non-neoplastic cells. Mesenchymal cells, in particular, exhibit a hyper activated ATP production and an enhanced glucose uptake. Based on these fundamentals, we developed a new approach for mesenchymal cancer cells detection by means of magnetic CoFe2O4 nanoparticles (MNPs) coated by 2-2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBDG), a fluorescent glucose analogue and by D-glucose molecule, as control. MNPs were synthesized, functionalized and finally characterized by Fourier Transform Infra Red (FTIR) spectroscopy and Scanning Electron Microscopy (SEM). MNPs mean size was around 27 nm for every sample. Considering two types of BC cells: epithelial-like (MCF-7) and mesenchymal-like (MDA-MB-231), it has been demonstrated that increasing the glucose concentration in the medium from 1 g/L (low glucose) to 4.5 g/L (high glucose), results in a selectively MNPs internalization by the mesenchymal subtype. In particular we used a breast cancer (BC) cell lines co-culture and thus we demonstrated the mesenchymal predisposition to uptake glucose coated MNPs both in normal and in high glucose conditions. We observed that the mesenchymal-like cells (MDA-MB-231), respect to the luminal-epithelial ones (MCF7), internalized a statistically significant higher amount of glucose coated CoFe2O4 NPs in both glucose concentrations. Internalization was investigated using advanced techniques as immunofluorescence, immuno-cyto-chemical assay, confocal microscopy and Focused Ion Beam (FIB) - SEM. The internalization MNPs mechanism has been further investigated by the selective blockage of glucose transporter channels, via a specific inhibitor (STF-31), resulting in a proportional uptake decrease as a consequence of the treatment. From a therapeutic point of view, the presence of MNPs inside the mesenchymal-like cells has been exploited for hyperthermia studies by exposing the cells to a localized Infra Red (IR) laser beam. Cells without MNPs were not affected by the IR laser while cells positive to MNPs have been warmed due to the IR absorbance characteristics of cobalt ferrite core, leading to cell damages and rearrangements. We, moreover, investigated the ability of White Blood Cells (WBCs), obtained by healthy donor, to internalize the CoFe2O4 – 2-NBDG NPs at both glucose medium concentrations, leading to a possible diagnostics applications in whole blood cells analysis. For this purpose, a microfluidics device has been developed for a possible isolation of MNPs-positive cells by applying an external magnetic field. The microfluidics chip was fabricated by the soft optical lithography method and the so obtained PDMS mold was bound to a glass slide by oxygen plasma treatment. Finite element computer simulation has been carried out for better understanding the magnetic displacement principles in microfluidics devices. Finally, the set up has been fabricated and tested with micron-sized magnetic beads for the separation yield evaluation. Concluding, thinking in terms of diagnostics we could infer that this method may lead to an alternative technique for mesenchymal cancer cells detection and isolation thanks to the magnetic properties of the MNPs used. Indeed, by applying an external magnetic field to a mixed sample of mesenchymal/epithelial cancer cells and WBCs it would be possible to isolate the mesenchymal-MNPs-positive ones. Moreover, our demonstration of localized heating could lead in the future to a possible therapeutics application in thermotherapy field.
Ciclo di dottorato: XXVII Ciclo
metadata.dc.subject.classification: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NANOTECNOLOGIE
Description: 2013/2014
Keywords: Nanoparticles
Cancer
Metabolism
CTCs
Microfluidics
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: FIS/07 FISICA APPLICATA (A BENI CULTURALI, AMBIENTALI, BIOLOGIA E MEDICINA)
NBN: urn:nbn:it:units-13697
Appears in Collections:Scienze fisiche

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