Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/10977
Title: Biomolecules as recognition elements for bioactive diterpenes in coffee
Other Titles: Biomolecole come elementi di riconoscimento per diterpeni del caffè
Authors: Guercia, Elena
Keywords: diterpenescoffeealbuminsbiosensor
Issue Date: 13-Apr-2015
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Al giorno d’oggi, il caffè rappresenta una delle principali materie prime commercializzate, la cui produzione mondiale si classifica seconda solo rispetto al petrolio e al primo posto in termini di materia prima alimentare. Essendo interamente prodotto nel Sud del mondo, il caffè costituisce la maggiore fonte di guadagno dei Paesi tropicali produttori, in cui viene denominato “oro verde”. Il motivo del suo successo mondiale come bevanda deriva dalla sensazione a livello gustativo e olfattivo che suscita in chiunque lo beva e dal suo ben noto effetto stimolante, attribuito principalmente alla caffeina. Per garantire un ottimo prodotto finale, ad esempio in Italia l’ Espresso, è necessario garantire e ricercare continuamente la qualità del caffè lungo tutta la sua catena di produzione: da “ciliegia” rossa a bevanda, questa materia prima percorre un lungo cammino in cui subisce molteplici e delicate trasformazioni. Il termine “qualità del caffè” assume quindi diversi significati a seconda del ruolo che ognuno può avere all’interno della catena di produzione. Per la illycaffè, nostro partner industriale, qualità significa bevanda di caffè costituita al 100% da Arabica, la specie di caffè più preziosa in commercio. La sua indiscussa qualità è dovuta principalmente alle sue caratteristiche organolettiche; infatti l’ Espresso derivante da Arabica è un caffè profumato, dolce, delicato e leggermente acido. Per questo motivo, è molto importante per illycaffè salvaguardarsi da possibili frodi o sofisticazioni, ovvero dalla contaminazione di Arabica da Robusta, l’altra specie (meno pregiata) di caffè presente in commercio. Per quanto riguarda la composizione chimica, la differenza fondamentale tra le due specie di caffè è la presenza, solo nella Robusta, del 16-O-methylcafestolo, diterpene contenuto nella porzione insaponificabile dell’olio di caffè. L’assenza di tale composto nell’ Arabica fa sì che esso sia un eccellente ‘molecular marker’ per l’identificazione di Robusta in una miscela di caffè, rilevandone così la mancanza di autenticità ove questa sia commercializzata come Arabica 100%. Questo progetto di tesi di dottorato nasce dall’interesse di sviluppare uno strumento capace di riconoscere il 16OMC in una miscela di caffè tostato, per esempio sfruttando biomolecole, come proteine e peptidi, che già naturalmente si comportano da recettori, o strutture molecolari progettate su misura con le caratteristiche per interagire selettivamente con i diterpeni. Questo sensore altamente specifico e selettivo per il 16OMC costituirebbe un kit d’analisi rapido ed efficiente in grado di proteggere la illycaffè da possibili frodi e adulterazioni. Per raggiungere questo obiettivo, per prima cosa è stata messa a punto una nuova metodica di estrazione e di purificazione dei diterpeni, principalmente cafestolo e 16OMC, da una miscela di caffè tostato Robusta 100%, perché si tratta di composti non facilmente reperibili sul mercato e molto costosi. I diterpeni estratti sono stati completamente caratterizzati, fornendo nuovi dati e/o confermando i dati già presenti in letteratura, talvolta incompleti. Inoltre questa metodica ci ha permesso di purificare e caratterizzare anche un altro componente della frazione insaponificabile del caffè: il β-sitosterolo, uno tra i più abbondanti steroli presenti nel caffè. Per lo sviluppo di un biosensore selettivo basato sull’interazione di una biomolecola con un composto target, sono stati considerati diversi approcci. Il primo approccio valutato è stato quello di partire da una proteina naturale, ben organizzata e stabile, e ridurre le sue dimensioni fino all’ottenimento di un peptide che risulti stabile e mantenga la funzionalità del sito attivo. In tale prospettiva è stata studiata tramite spettroscopia di fluorescenza l’interazione tra diterpeni e albumina umana (HSA), albumina umana priva di acidi grassi (ff-HSA), albumina bovina (BSA) e il recettore nucleare FXR (Farnesoid X Receptor). Gli esperimenti sono stati fatti in condizioni fisiologiche. Per quanto riguarda le albumine, si è osservato che i siti coinvolti nell’interazione con i diterpeni sono il sito denominato Sudlow site I, in cui è presente il Trp, causando una alterazione della fluorescenza, e il sito degli acidi grassi, contiguo al sito I, andando a modificare drasticamente la conformazione della proteina. Un’analisi degli spettri di dicroismo circolare registrati in presenza di sola albumina e successivamente aggiungendo diterpeni hanno confermato questo cambio conformazionale. Cafestolo e 16OMC presentano affinità per le albumine simili a quelle di altre piccole molecole capaci di legarsi ad esse. Tuttavia i dati ottenuti sono stati utili da un punto di vista fisiologico. L’interazione tra cafestolo e FXR, recettore coinvolto nell’omeostasi del colesterolo, è stata studiata per ottenere informazioni sull’attività biologica e per valutare il recettore come un potenziale strumento per la progettazione di biosensori. FXR è in grado di legare il cafestolo con una affinità molto elevata. La costante di dissociazione ottenuta (KD), 50 nM, è molto promettente. E’ da considerarsi, tuttavia, come un dato preliminare e studi che confermano questa ipotesi sono ancora in corso. Un ultimo approccio ha riguardato la modifica strutturale dei diterpeni. L’idea è quella di legare dei linkers all’anello furanico dei due diterpeni in modo da lasciare liberi il diolo del cafestolo e l’etere del 16OMC, poiché sono i gruppi funzionali che vogliamo discriminare. Il legame con il linker permette di immobilizzare i diterpeni modificati a supporti solidi, come chip d’oro, e di eseguire rapidamente screening di librerie peptidiche e selezionare i peptidi più promettenti tra i tanti componenti di una libreria. Per questo scopo, dopo protezione degli ossidrili di cafestolo (tramite acetonide) e 16OMC (formazione di etere), è stata eseguita l’alchilazione del furano. Tale via è ancora in fase di sviluppo.
Nowadays coffee represents the most traded food commodity, global coffee production ranks second in value only to oil and in many tropical coffee-producing countries, it constitutes the main source of income (it is considered the “green gold”). The worldwide success of coffee beverages is due to the involvement of our sense (taste and smell) and the well-known stimulating effect, mainly attributed to caffeine. To guarantee the best final product, for instance the Espresso in Italy, there should be a continuous pursuit of quality along the whole production chain: from red cherries to cup, the raw beans undergo a lot of significant transformations. The term “coffee quality” means different things to different people involved in the coffee supply chain. For illy company, our industrial partner, coffee quality means coffee beverages composed of 100% Arabica coffee, the most precious coffee in the trade. Its quality is due, mainly, to its organoleptic characteristics: roasted Arabica beans produce a very fragrant, sweet, smoother and slightly acidic coffee; very often it has chocolate note and caramel after-taste. For these reasons, illy company focuses its attention to protect itself from frauds and adulterations as soon as illy coffee is on the trade. By frauds and adulterations illy means contamination of 100% Arabica through Robusta, the other coffee species present on the trade and cheaper than Arabica. The two species present chemical differences. The most important is the presence, only in Robusta coffee, of 16-O-methylcafestolo, diterpene contained in the unsaponifiable matter of coffee oil. As this compound is absence in Arabica coffee, it is considered a ‘molecular marker’ of potential frauds, since it could identify and confirm the presence of Robusta in a mixture of roasted coffees when it is commercialized as Arabica 100%. This PhD project arises from the interest in searching new methodologies for the selective analysis of diterpenes, exploiting the recognition properties of biomolecules, proteins or peptide, or of designed sensing elements with high affinity for such diterpenes compounds, especially for 16OMC. This specific and selective biosensor for 16OMC would constituted a kit analysis able to protect illy company from frauds and adulterations. Firstly, a new methodologies was performed for the extraction and the purification of diterpenes, especially cafestol and 16OMC, from a mixture of coffee Robusta 100%, because the availability on the trade of these compounds is uncommon and they are quite expensive. The diterpenes extracted were fully characterized providing new data and / or confirming the data already present in the literature, which sometimes are incomplete. Moreover, this method allowed us to purify and characterize another component of the unsaponifiable fraction of the coffee: the β-sitosterol, one of the most abundant sterols present in coffee. For the development of a biosensor selective based on the interaction of a biomolecule with a target compound , different approaches may be considered. The first approach evaluated was the use of natural peptide scaffolds, with stable and highly organized conformations, and reduce its dimension down to the limit of receptor stability. In this perspective, the specific binding constants to human serum albumin (HSA), fatty free – human serum albumin (ff-HSA), bovine serum albumin (BSA) and farnesoid X receptor (FXR) of diterpenes were measured in physiological conditions by fluorescence spectroscopy. As for the albumins, we observed that the sites involved in the interaction with diterpenes are the Sudlow site I, in which the Trp is present, causing a change in the fluorescence, and the site of fatty acids, contiguous to the site I, going to drastically alter the secondary structure of the albumins. CD spectra of the albumins upon addition of diterpenes confirmed these conformational changes. Cafestol and 16OMC have affinity for albumins similar to those of other small molecules capable of binding to them. However, the data obtained are useful from a physiological point of view. The interaction between cafestol and FXR, involved in the cholesterol homeostasis, was studied to obtain information on the biological activity and to evaluate the receptor as a potential sensing tool. FXR bound cafestol with a very high affinity. The dissociation constant obtained (KD), 50 nM, is very promising. This result is very relevant both under the biological point of view and under the potential application of FXR in a sensing system able to selectively discriminate cafestol and 16OMC from a mixture of roasted coffee. Further studies are undergoing. Moreover, another approach was the modification of diterpenes with linkers. The furan ring of cafestol and 16OMC was identified the starting point for the bound with linkers, since we wish to discriminate between the glycol system of cafestol and the ether of 16OMC. The final purpose is to immobilize the modified diterpenes on a solid support, such as a gold chip, and to screen the binding properties. The diol system of cafestol and the hydroxyl group of 16OMC were protected and then, the furan ring was alkylated. Further modification will be performed in our research group.
Description: 2013/2014
URI: http://hdl.handle.net/10077/10977
NBN: urn:nbn:it:units-13822
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