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Title: Characterization of cancer behaviour after laser biostimulation at cellular and molecular level
Other Titles: Characterization of cancer behaviour after laser biostimulation at cellular and molecular level
Analisi cellulare e molecolare del comportamento del tumore dopo biostimolazione laser
Authors: Ottaviani, Giulia
Supervisore/Tutore: Biasotto, Matteo
Zacchigna, Serena
Issue Date: 26-Mar-2015
Publisher: Università degli studi di Trieste
The main aim of this project is to provide an answer to the following issues:
- on the one hand the definition of the cellular and molecular mechanisms of action of the laser therapy and its interaction with tissues
- on the other hand the safety of laser therapy and is potential consequences on cancer behaviour
We created a mouse model of oral carcinogenesis to assess potential differences in tumour angiogenesis in tissues treated with laser therapy compared to the control ones, by using both histological analysis and injection of Nano FluoSpheres®. A chemical carcinogen (4-NQO) dissolved in their drinking water was administered to C57BL/6 female mice (n = 50), 8-week old, since this compound is able to induce the formation of multiple oral tumours. Among these, 25 mice underwent to 4 session of laser therapy on consecutive days employing the HPLT-1 protocol, while the remaining mice were used as controls. During the 21st week, 15 animals per group were sacrificed to perform an accurate histological analysis of their tongue, while 10 were subjected to a quantitative assessment of angiogenesis through a 3D reconstruction of the tumour vascular network after the in vivo perfusion with Nano FluoSpheres®. Any increase concerning neither the number/extension of dysplastic and neoplastic areas nor tumour angiogenesis was registered in the treated group. Moreover, treated animals showed a tendency to border and to isolate tumour areas. The laser seemed to normalize tumour vessels, promoting their covering by smooth muscle cells, thus reducing ectasia and vascular permeability, as assessed by reduced Nano FluoSpheres® leakiness.
The histological analysis performed on the oral carcinogenesis mice model was compared to the images of the same tumours acquired by Narrow Band Imaging. Three raters experienced in the use of this technology analyzed the images, classifying all visible lesions according to different pathological grades; the obtained results were than compared with the histological analysis, used as reference standard. The statistical analysis revealed both high sensitivity (96%) and specificity (99%) for this technology. Supported by other studies, the Narrow Band Imaging is expected to hold great potential for the clinical evaluation of tumour angiogenesis, as well as for the early detection of potentially malignant lesions of the oral cavity.
The important clinical outcome in term of wound healing and our interest in the analysis of cell behaviour after laser therapy were the starting point for the evaluation of the effect of laser therapy on different cell lines: Human Skin Fibroblasts, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Human Coronary Artery Smooth Muscle Cells, Neonatal Rat Ventricular Myocytes, Human Bone Osteosarcoma Epithelial Cells and Mouse B16F10 Melanoma Cells. We set different powers, energies and wavelengths, and we performed the evaluations at different experimental times (6, 24, 48 and 96 hours after the irradiation). In general, laser irradiation resulted in an increase of both cell metabolism (ATPlite) and proliferation (cell count, AlamarBlu, BrdU incorporation), albeit with different timing and intensity in the various cell lines. Consistent with published results, we observed a clear increase in cancer cell metabolism upon laser irradiation; to evaluate the cancer behaviour in vivo, the same melanoma cells were implanted in C57BL/6 female mice (n = 16), 6-week old, at the dorsal subcutaneous level. As soon as the masses were visible to the naked eye (approximately on day 10), mice were homogeneously divided into 4 groups according to tumour size: 3 groups were subjected to different laser protocols (LPLT-6; MPLT-13 and HPLT-7) for 4 consecutive days (days 11 to 14), while the fourth group was used as control. On day 15, all animals were euthanized to measure the tumour volume and weight. A deep histological analysis on tumour invasion and cancer immune response (CD1a, CD4, CD8, CD25, CD68 kp1 and Melan-A) was performed, as well as the analysis of the expression levels of cytokines involved in the immune system activation (TNFα, IFNα and IFNγ). Laser therapy did not foster tumour growth or invasiveness (CD68 kp1 and Melan-A), but rather seemed to contain its extension. Moreover, in the laser groups, tumour infiltration by immune cells was much more higher compared to the control ones (CD4+, CD8+, CD25+ cells), consistent with the increased expression of IFNγ. Of notice, CD1a positive dendritic cells were particularly abundant in the dermis in the control group, while they migrated to "wrap" the tumour in laser groups.
Based on these results, we applied the same laser protocols on primary mouse bone marrow dendritic cells, with and without lipopolysaccharide stimulation. These cells did not enhance cell metabolism upon laser treatment, but reduced TNFα and increased IFNγ expression. Finally, CD-1 female mice (n = 30), age 6-7 weeks old, were used to assess the expression of different cytokines (Collagen I, Collagen III, Collagen IV, FSP1, IL-2, IL-6, IL-10, IFNα, IFNβ, IFNγ, MMP-9, PDGFβ, TGFβ, TNFα) after the laser therapy at the dorsal level with and without the presence of a skin wound. The analysis confirmed an increase in the IFNγ expression; a similar trend was registered concerning IL-2, IL-6, IFNα, IFNβ, Collagen I, Collagen III, MMP-9, PDGFβ expression in the laser treated mice compared to controls.
From both in vitro and in vivo analysis we can state that the laser therapy is effective in stimulating cell metabolism and proliferation, and in boosting a potent immune response in vivo. We can therefore foresee that the treatment of cutaneous and mucosal lesions in oncological patients can be safely performed even in potentially dysplastic or neoplastic areas.

Il progetto di ricerca nasce da una duplice esigenza clinica:
- da un lato quella di poter descrivere e spiegare da un punto di vista biologico e cellulare il funzionamento della terapia laser e la sua interazione con i tessuti
- dall’altro quella di valutare il comportamento neoplastico in seguito a biostimolazione laser
Per far ciò è stato creato un modello murino di carcinogenesi della lingua, al fine di valutare, sia da un punto di vista istologico sia attraverso l’iniezione di Nano FluoSfere®, se vi siano differenze riguardanti l’angiogenesi tumorale nei tessuti irradiati con laser terapia rispetto ai controlli. A 50 topi (ceppo C57BL/6, sesso femminile, età 8 settimane) è stato somministrato un carcinogeno chimico (4-NQO) disciolto in acqua, noto per indurre la formazione di multipli tumori del cavo orale. Di questi, 25 sono stati sottoposti a 4 sessioni in giornate consecutive di laser terapia utilizzando il protocollo HPLT-1, mentre i rimanenti 25 sono stati utilizzati come controlli. Alla 21° settimana 15 animali per gruppo sono stati sacrificati per eseguire un’accurata analisi istologica della lingua, mentre i restanti sono stati sottoposti ad una valutazione quantitativa dell’angiogenesi tramite ricostruzione 3D della rete vascolare neoplastica dopo perfusione in vivo con Nano FluoSfere®. Non è stato riscontrato alcun aumento delle zone displastiche, neoplastiche, né dell’angiogenesi nei topi trattati con il laser. In particolare, gli animali trattati con il laser hanno presentato una tendenza maggiore ad isolare le zone carcinomatose rispetto ai siti sani. Il laser ha normalizzato i vasi tumorali, inducendone il rivestimento da parte delle cellule muscolari lisce e riducendo l’ectasia e la permeabilità vascolare, senza stravaso di Nano FluoSfere®.
I risultati istologici ottenuti sul modello di carcinogenesi orale animale sono stati comparati alle immagini degli stessi tumori, acquisite tramite fibroscopia in Narrow Band Imaging. Tali immagini sono state analizzate da tre raters esperti nell’uso di tale metodica permettendo di eseguire un’attenta analisi sulla neo-angiogenesi. L’analisi statistica ha messo in luce alti indici di sensibilità (96%) e specificità (99%) per questa tecnologia. Supportata da altri studi, la Narrow Band Imaging potrà avere importanti implicazioni sulla valutazione clinica dell’angiogenesi tumorale, così come sulla diagnosi precoce delle lesioni potenzialmente maligne del cavo orale.
Visti i risultati ottenuti a livello clinico sulla guarigione delle ferite e visto l’interesse ad analizzare il comportamento cellulare, la terapia laser è stata inoltre testata su differenti linee cellulari: fibroblasti cutanei umani, cellule endoteliali umane derivate da cordone ombelicale, cellule muscolari lisce di arterie cardiache umane, miociti ventricolari di ratto neonatale, cellule di osteosarcoma e di melanoma murino. Sono state utilizzate diverse potenze, energie e lunghezze d’onda, nonché diversi tempi sperimentali (6, 24, 48 e 96 ore a distanza dall’irraggiamento), registrando, seppur con tempistiche ed efficacia differenti, un aumento sia del metabolismo (ATPlite) sia della proliferazione nei gruppi laser (conta cellulare, AlamarBlu, incorporazione di BrdU) in tutte le linee cellulari. Visti i risultati ottenuti su cellule neoplastiche in vitro, le medesime cellule di melanoma sono state impiantate in 16 topi (ceppo C57BL/6, sesso femminile, età 6 settimane) a livello sottocutaneo dorsale. Non appena la massa è risultata visibile ad occhio nudo (giorno 10) i topi sono stati suddivisi in 4 gruppi omogenei per dimensioni del tumore: tre gruppi sono stati sottoposti a differenti trattamenti laser (LPLT-6; MPLT-13 e HPLT-7) per 4 giornate consecutive (giorni 11-14), mentre il quarto è stato utilizzo come controllo. Al giorno 15 tutti gli animali sono stati sacrificati per misurare il volume ed il peso della massa tumorale, per l’analisi dell’invasione e della risposta immunitaria neoplastica (CD1a, CD4, CD8, CD25, CD68 kp1 e Melan-A) tramite colorazioni immunoistochimiche, e per l’analisi dei livelli di espressione di citochine coinvolte a livello immunitario (TNFα, IFNα e IFNγ). La terapia laser non ha provocato una maggior estensione né aggressività delle neoplasie, che al contrario sono risultate più contenute e di dimensioni minori rispetto al gruppo controllo (CD68 kp1 and Melan-A). Inoltre, nei gruppi laser è stato evidenziato un incremento della risposta immunitaria (CD4+, CD8+, CD25+), consistente con l’aumentata espressione di IFNγ. Da sottolineare la diversa disposizione delle cellule dendritiche CD1a positive, maggiormente presenti a livello dermico nel gruppo controllo, e migrate a “contornare” la neoplasia nei gruppi trattati.
Sulla base di questi risultati abbiamo utilizzato i medesimi protocolli laser per irradiare cellule dendritiche primarie di topo, con e senza stimolazione mediante lipopolisaccaride. Queste cellule non hanno risposto in termini di modificazione del metabolismo, ma hanno ridotto l’espressione di TNFα e incrementato quella di IFNγ. Infine, in un modello murino sono stati analizzati 30 topi (ceppo CD-1, sesso femminile, età 6-7 settimane) che hanno subito la terapia laser a livello dorsale, con e senza la presenza di una ferita cutanea. L’analisi dell’espressione di un pannello di citochine (Collagene I, Collagene III, Collagene IV, FSP1, IL-2, IL-6, IL-10, IFNα, IFNβ, IFNγ, MMP-9, PDGFβ, TGFβ, TNFα) ha portato a confermare nuovamente l’incremento di IFNγ, ma anche di IL-2, IL-6, IFNα, IFNβ, Collagene I, Collagene III, MMP-9, PDGFβ nei topi laser trattati rispetto ai controlli.
Dai risultati ottenuti in vivo ed in vitro possiamo affermare che la laser terapia è efficace nella stimolazione cellulare, aumentandone il metabolismo e la proliferazione, e soprattutto di stimolare una potente risposta immunitaria in vivo. Possiamo pertanto prevedere che il trattamento di lesioni e ferite mucose e cutanee tramite biostimolazione laser potrà essere eseguito in sicurezza anche in aree potenzialmente displastiche o neoplastiche.
Ciclo di dottorato: XXVII Ciclo
metadata.dc.subject.classification: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NANOTECNOLOGIE
Keywords: Laser therapycell metabolismtumor growthangiogenesisimmune-modulation
Type: Doctoral
Language: en
Settore scientifico-disciplinare: MED/28 MALATTIE ODONTOSTOMATOLOGICHE
NBN: urn:nbn:it:units-14064
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