Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/10077/11563
Titolo: PRODUCTION AND STRUCTURAL INVESTIGATION OF GLYCANS AND PROTEINS OF GLYCOBIOLOGICAL RELEVANCE
Autore/i: RUSTIGHI, ISABELLA
Contributore: VITTUR, FRANCO
Data: 12-apr-2007
Editore: Università degli studi di Trieste
Abstract: 
Se si considerano i carboidrati non solo per il loro più semplice ruolo di riserva energetica nel sostentamento de11a vita ma anche per que11o più intrigante di modulatori della comunicazione cellulare, entriamo nel campo della glicobiologia. Quest'aspetto non-triviale della funzione dei glicani deriva dalla loro inerente complessità strutturale (grande varietà di legami e possibilità di ramificazione) e dalla loro localizzazione ubiquitaria nella cellula e nella matrice extracellulare. La maggior parte dei glicani ricopre densamente la parte esterna della superficie cellulare ed è esposta ad un ambiente ricco di proteine (come i fattori di crescita, citochine, tossine, enzimi ed altro). Questa posizione preferenziale permette loro di mediare numerose interazioni tra cellule o tra cellula e matrice extracellulare e di fungere da "agenti del traffico" in molti processi cellulari (riconoscimento, adesione, proliferazione e differenziamento). Perciò, la comprensione della funzione biologica peculiare svolta dai carboidrati, non può prescindere dalla caratterizzazione strutturale dei saccaridi, considerati o come catene a se stanti o come parte integrante di glicoconiugati, e dei loro partners d'interazione proteici. Scopo. Lo scopo del presente lavoro è essenzialmente di tipo metodologico, ossia rivolto allo sviluppo di tecniche e procedure sperimentali per l'analisi (identificazione/rilevamento, caratterizzazione, sintesi) di determinate sequenze saccaridiche frequentemente riscontrate in natura, di glicoproteine e di proteine che legano carboidrati. l. Derivatizzazione di saccaridi per il rilevamento UV-visibile all'elettroforesi capillare (CE) Per quanto riguarda la determinazione della composizione in monosaccaridi, che spesso rappresenta il primo passo per la completa elucidazione strutturale di un campione zuccherino, abbiamo sviluppato ed ottimizzato delle metodologie sperimentali volte ad un migliore rilevamento UV-visibile di mono- ed oligosaccaridi presenti in glicoproteine di mammiferi e pianta. I carboidrati sono privi di gruppi cromofori e debbono essere opportunamente derivatizzati, cioè legati covalentemente ad un cromoforo, solitamente per amminazione riduttiva, prima di essere analizzati alla CE. Le rese di derivatizzazione, tuttavia, dipendono dalla natura del residuo saccaridico e gli zuccheri N-acetilati, come l'N-acetilgalattosammina (GalNAc) e l'Nacetilglucosammina (GlcNAc) che occupano, rispettivamente, il terminale riducente di 0- ed N-glicani, sono notoriamente difficili da derivatizzare. Si è quindi condotto uno studio comparativo finalizzato al miglioramento della procedura di derivatizzazione, aumentando il grado di rilevabilità degli zuccheri N-acetilati. I risultati hanno mostrato come, tra vari agenti derivatizzanti comunemente usati, l'acido 2-aminobenzoico sia il più efficiente, otirendo alta e pari sensibilità al detector UV-vis per tutti i saccaridi analizzati. Inoltre, scegliendo adeguate condizioni di corsa alla CE, una miscela di undici monosaccaridi è stata efficientemente separata in un intervallo di tempo assai ristretto. 2. Sintesi di N-acetillattosamina (LacNAc) con beta-galattosidasi immobilizata I risultati sopra menzionati, relativi ad una efficace procedura di derivatizzazione di zuccheri riducenti, sono stati applicati con successo al rilevamento di LacNAc da miscele di reazione grezze via CE. Questo disaccaride è solitamente situato nella porzione più esterna di oligosaccaridi complessi facenti parte della superficie cellulare ed è quindi direttamente coinvolto in processi di riconoscimento cellulare. Qui è stata provata la sintesi enzimatica in fase eterogenea di LacNAc. Lo scopo dello studio era quello di migliorare sia la resa del prodotto ma anche il recupero del biocatalizzatore attraverso la sua immobilizzazione su supporto solido (polimeri commerciali Eupergit® e Sepabeads) in confronto alla stessa sintesi effettuata con enzima libero in soluzione. La biosintesi è stata fatta per reazione di transglicosilazione con betagalattosidasi da B. circulans partendo da p-nitrofenil galattopiranoside (come glicosil donatore) e GlcNAc (come glicosil accettore). La reazione è stata seguita monitorando via CE la produzione di disaccaride in funzione del tempo. L'analisi cinetica ha rivelato che la procedura di immobilizzazione non sopprime l'attività catalitica ma, al contrario, incrementa l'efficienza di trasferimento di galattosio dell'enzima. I profili cinetici delle reazioni effettuate con Eupergit® o Sepabeads sono risultate essere molto diversi, suggerendo che le proprietà chimico-fisiche delle matrici di supporto influenzano il comportamento dell'enzima. La resa molare massima di LacNAc (64%) è stata ottenuta usando Eupergit® come carrier polimerico. 3. Analisi strutturale di glicani L'identificazione e l'analisi quantitative di porzioni oligosaccaridiche di glicoproteine di importanza biotecnologica, come la beta-glucosidasi, o terapeutica, come le proteine di membrana di linee cellulari epatiche, è stata qui affrontata seguendo due strategie di processamento glicoproteico alternative. (3a) Prima del rilascio sul mercato, beta-glucosidasi (GCasi) ricombinante prodotta da semi di tabacco transgenico, deve essere ampiamente caratterizzata al fine di verificare se lo schema di glicosilazione della glicoproteina espressa in pianta somiglia a quello della CGasi da placenta umana. Il trattamento con acido trifluoroacetico ha portato ad idrolisi esaustiva del campione saccaridico e sui monosaccaridi rilasciati si è svolta un'analisi CE. Dal momento che non sono stati ritrovati né fucosio né xilosio, unità monosaccaridiche frequenti in glicoproteine vegetali, si è potuta escludere una potenziale immunogenicità per la somministrazione all'uomo. (3b) La rilevanza scientifica dello studio della struttura glicanica di proteine di membrana, differentemente espresse in linee cellulari epatiche sane o cancerose, sta nella possibile diagnosi di markers tumorali saccaridici, presenti già nella fase precoce dell'insorgere del tumore. Al fine di sviluppare e ottimizzare delle procedure metodologliche, basate sulla deglicosilazione enzimatica in soluzione o in gel (con PNGasi F) con rilascio delle catene oligosaccahridiche intatte e analisi LC/MS dell'idrolizzato, da esportare poi ali' analisi del pattern di glicosilazione delle proteine di membrana, è stata qui utilizzata fetuina bovina commerciale come modello di una proteina pesantemente glicosilata. Dai dati ottenuti, una struttura biantennaria e due triantennarie sono state infine assegnate. 5. Biosintesi su ampia scala di un lisozima da H.pylori Un grande sforzo è stato dedicato allo studio di un Iisozima da H.pylori (Lys ), un enzima che sembra svolgere un ruolo chiave nell'autolisi del batterio durante la colonizzazione dell'epitelio gastrico dei primati. Al fine di tentare una caratterizzazione strutturale della proteina, sola ò in associazione con il suo substrato saccaridico (acido N-acetylmuramico), si è reso necessario lo "'scaling-up" dei processi di biosintesi e purificazione. Ciò è stato possibile dopo l'identificazione del gene codificante la sequenza del lisozima in H.pylori e clonaggio del frammento di DNA di interesse inun vettore d'espressione adeguato, promuovendo l'espressione ad alti livelli in E. coli. Due sistemi d'espressione sono stati provati: Il sistema pGEX ha prodotto il Lys come proteina di fusione con la GST, preferenzialmente prodotta in Eco/i come corpi di inclusione, specialmente quando sono stati usati grandi volumi di colture batteriche. La proteina è stata isolata dal precipitato cellulare insolubile, solubilizzata e successivamente ripiegata con successo. Dopo purificazione e taglio proteolitico con trombina per la rimDziDne della coda GST da Lys, le prove di attività litica sono risultate essere positive, nonostante la fallita separazione tra le due proteine. Studi di affinità su tali campioni condotti alla CE, non hanno portato nessuna evidenza a favore dell'affinità di Lys per un disaccaride (LacNAc) che mima il substrato naturale di Lys. Quindi il vettore pET è stato successivamente scelto per esplorare una stategia di clonaggio alternativa. Il sistema d'espressione ha fornito Lys con coda poliistidinica C-terminale. Anche in questo caso la proteina è stata recuperata quasi interamente nella frazione insolubile del lisato cellulare. Dopo processo di rinaturazione, direttamente effettuato in colonna d'affinità Ni-NTA agarosio, si è ottenuta proteina ad un elevato grado di purezza ma inattiva. L'intero lavoro è stato svolto all'Università di Trieste, nel dipartimento di Biochimica, Biofisica e Chimica delle Macromolecole nel laboratorio del Prof. S.Paoletti sotto la supervisione della dott.ssa A.Gamini, dove ho avuto la possibilità di imparare i rudimenti della biochimica analitica. All'intemo del progetto lisozima da H.pylori, è stata di grande importanza la permanenza durata 4 mesi all'Università di Halle-Wittenberg all'Istituto di Biotecnologia (Germania) nel laboratorio del Prof R.Rudolph e sotto la supervisione del Dott. C.Lange che mi ha portato ad acquisire esperienza nel campo della chimica delle proteine.

lf carbohydrates are viewed not merely as energy suppliers for sustaining life but their intriguing biological role, chiefly as modulators of cell communication, is investigated, then we approach the field of glycobiology. This nontrivial task of glycans arises from their inherent structural complexity (great variety of linkage and branching occurrence) an d their ubiquitous location in the cell and extracellular matrix. Most glycans densely cover the outer cellular surface and are exposed to an environment of many proteins (such as growth factors, cytokines, toxins, enzymes and others). This particular position enables them to mediate several cell-cell or cell-matrix interactions and act as recognition determinants in a great variety of important cellular events ( adhesion, proliferation and differentiation). Therefore, the comprehension of the unique function of carbohydrates in biology calls for a structural characterization of saccharides, considered either as sugar chains or as integral part of glycoconjugates, and their interaction partners, such as carbohydratebinding proteins. The aim of the present work was essentially methodological in kind, i.e. directed towards the development of techniques and experimental procedures for the analysis (identification/detection, characterization, synthesis) of given carbohydrate sequences, frequently occurring in nature, glycoproteins and sugar-binding proteins. l. Derivatization of saccharides for UV -visible detection on capillary electrophoresis CE). Concerning the compositional monosaccharide determination of a hydrolyzed glycan pool, which is frequently the first step in oligosaccharide mapping, we developed and optimized experimental methods aimed to improve the UV -vis detection of monoand oligosaccharides present as widespread components in mammalian and plant glycoproteins. Saccharides inherently lack chromophores and must be suitably derivatized, i.e. covalently linked to a chromophore usualiy through reductive amination, prior to detection on CE. Derivatization yield, however, depends on the nature of the sugar residue and N-acetylamino sugars, such as N-acetylgalactosamine (GalNAc) and N-acetylglucosamine (GlcNAc), occupying the reducing end of respectively 0- and N-glycan sequences, are notoriously difficult to label. A comparative study aimed at the improvement of a labelling procedure, enhancing the detectability of N -acetylamino sugars, was therefore performed. The results showed that, among frequently used tagging dyes, 2-aminobenzoic acid turned out to be the most efficient, offering high and comparable sensitivity at the CE UV -vis detector for ali saccharides tested. Choosing adequate CE running conditions, a mixture of eleven monosaccharides was efficiently separated in a very short time frame. 2. Immobilized beta-galactosidase-based synthesis ofN-acetyllactosamine (LacNAc) The abovementioned findings of suitable derivatization procedure for the UV -vis detection of reducing sugars was successfully applied to the detection of LacNAc from crude reaction mixtures via CE. This disaccharide is very commonly located at the outermost portion of complex celi surface oligosaccharides of glycoconjugates and is therefore directly involved in recognition processes between cells. The enzymatic synthesis in heterogeneous phase of the LacNAc disaccharide was here attempted. The goal of the study was to improve both product yield and recovery of the biocatalyst through its immobilization on solid supports (commercial polymers Eupergit® and Sepabeads ), in comparison with the synthesis performed with the free enzyme in solution. The biosynthesis was performed through transglycosylation reaction with beta-galactosidase from B. circulans starting from p-nitrophenyl galactopyranoside as the glycosyl donor and GlcNAc as the acceptor. The reaction was followed monitoring via CE the disaccharide production in function of time. The kinetic analysis revealed that the immobilization procedure did not suppress catalytic activity, but, on the contrary, improved the galactose transfer efficiency of the enzyme. Kinetic profiles of the reactions performed with Eupergit® or Sepabeads were qui te different, suggesting that the physico-chemical properties of the supporting matrices infuence enzyme behaviour. Maximum LacNAc molar yield (64%) was obtained using Eupergit® as solid carrier. 3. Glycan structure analysis The identification and quantitative analysis of oligosaccharide portions of glycoproteins of biotechnological, like beta-glucosidase, or therapeutical interest, such as membrane proteins of hepatic celllines, was here carried out according to two alternative glycoprotein processing strategies. (3a) Prior to commercialization, recombinant beta-glucosidase (GCase) produced in transgenic tobacco seeds must be first thoroughly characterized in order to test whether the glycosylation pattem of the glycoprotein expressed in plant resembles that of the human placenta} GCase. Treatment with trifluoroacetic acid led to exhaustive hydrolysis of the glycan moiety and o n the released monosaccharides a CE analysis was carried out. Since neither fucose nor xilose, frequent sugar residues found in plant glycoproteins, could be detected, potential immunogenicity for delivery to humans was excluded. (3b) The scientific relevance of studying the glycan structure of membrane-bound proteins, differently expressed in a healthy and hepatoma cell line, relies on the possible detection of early-stage saccharidic tumoral markers. In order to develop and optimize a methodological procedure, based on the in-solution or in-gel enzymatic release (with PNGase F) of entire oligosaccharide chains and analysis through LC/MS of the hydrolizate, that could be exported to the glycosylation pattem analysis of membrane proteins, the commerciai bovine fetuin was here used as a model of a heavily glycosylated protein. From the obtained data, a biantennary and two triantennary oligosaccharide structures, pertaining to the N-glycosylation profile of Fet, could be finally assigned. 5. Large-scale biosynthesis of a Hpylori lysozyme Much effort has been devoted to the study of a Hpylori lysozyme (Lys), an enzyme that seems to play a key role in the autolysis of the bacterium during colonization of the gastric epithelium of primates. In order to attempt structural characterization of the protein, either alone or in complexed form with its saccharidic substrate (Nacetylmuramic acid), the scaling-up of the biosynthesis and the purification procedures were required. This could be performed after identification of the gene encoding the lysozyme sequence in Hpylori and cloning the DNA sequence of interest into a suitable expression vector and promoting high-level expression of the Lys in E. coli. Two expression systems were tested: the pGEX system yielded the Lys as fusion protein with GST, which was produced preferentially as inclusion body in E. coli host cells, especially when larger culture volumes were used. The protein was isolated from insoluble cell pellet, solubilized and successfully refolded. After purification and digestion with thrombin protease to remove the GST fusion tag from the Lys protein, tests for lytic activity were positive, even though separation could not be achieved. Binding studies performed through affinophoresis on these samples, unfortunately did not provide any evidence of the affinity of Lys fora disaccharide (LacNAc) mimicking the natural sugar substrate. The pET vector was therefore chosen for an alternative cloning strategy. The expression system gave the Lys with a C-terminai 6xHis-tag. Also in this case the protein was almost totally recovered in the insoluble fraction of the celllysate. After a refolding step, directly performed on Ni-NTA agarose affinity column, highly pure, but unactive protein was obtained. The whole work was carried out at the University of Trieste, department of Biochemistry, Biophysics and Macromolecular Chemistry in the laboratory of Prof. S.Paoletti under the supervision of Dr. A.Gamini, where I had the opportunity to learn the basic issues of analytical biochemistry. Within the Hpylori lysozyme project, a four-months stay at the Martin-Luther University of Halle-Wittenberg at the Institute of Biotechnology (Germany) in the laboratory of Prof. R.Rudolph and under the supervision of Dr. C.Lange was of great importance for getting expertise in the field of protein chemistry.
Descrizione: 
2004/2005
Tipologia: Tesi
URI: http://thesis2.sba.units.it/store/handle/item/12289
http://hdl.handle.net/10077/11563
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