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Title: Rola of collagen cross-linkers on the stability of bonded interface
Other Titles: Role of collagen cross-linkers on the stability of the bonded interface
Authors: Angeloni, Valeria
Supervisore/Tutore: Breschi, Lorenzo
Issue Date: 26-Mar-2015
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Restorative adhesive dentistry is based on the infiltration of dental adhesive resin within the dentin collagen network creating the hybrid layer. The stability and integrity of collagen fibrils within the hybrid layer are crucial for the maintenance of bond effectiveness over time. The matrix metallo-proteinases enzymes (MMPs), which are endogenous enzymes present in dentin tissue, are claimed to play a key role in affecting the integrity of the hybrid layer causing the hydrolysis and degradation of dentin collagen. The aim of this research project was to evaluate the efficacy of different cross-linking agent in preserving the adhesive/dentin layer. Two water soluble collagen cross-linking agents riboflavin, and the carbodiimide hydrochloride, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] (EDC) were initially tested, then additional cross-linking agents were included in the study: acrolein, (water soluble), and the N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (soluble in acetone and ethanol). The concentration of each solution was chosen according to the previous studies: 0.1% riboflavin/wt, 0.3M EDC/wt, 0,01% acrolein/wt, 0.5M DCC/ethanol, 0.5M/acetone. Cross-linkers were associated to different adhesive systems available on the market and different tests were performed to evaluate the ability of cross-linkers in preserving the hybrid layer: mechanical test (microtensile bond strength), qualitative test (nanoleakage analysis), and biochemical assays (zymographic analysis and in situ zymographic analysis). For the microtensile bond strength recently extracted third molars (N=5 for each group) were selected and restorative treatments were performed: in the experimental groups teeth were pretreated with the tested cross-linkers before the application of the adhesive systems (XP Bond, Scotch Bond 1XT, Optibond FL, Clearfil SE), while in the control groups the adhesives were applied according to the manufacturers’ instructions. The experimental groups were divided as follow: 1) 0.1% riboflavin/XP Bond; 0.3M EDC/Scotch Bond 1XT; 2) 0.3M EDC+XP Bond 3) 0.3M EDC+Scotch Bond 1XT; 4) 0.3M EDC+Optibond FL; 5) 0.01% acrolein+Scotch Bond 1XT; 6) 0.3M EDC+Clearfil SE. The bonded specimens were serially sectioned to obtain approximately 1-mm-thick beams in accordance with the microtensile non-trimming technique. Beams were stored at 37°C in artificial saliva to reproduce the oral cavity environment and then were stressed to failure after 24hours (T0), 6 months (T6) or 1 year (T12) using a simplified universal testing machine at a crosshead speed of 1 mm/min. Data were analyzed using Two-Way (variables: cross-linker pretreatment and storage time) analysis of variance (ANOVA) and post hoc Tukey test (p values < 0.05 were considered as statistically significant). The results of microtensile bond strength showed that the use of the tested cross-linkers tested does not affect the immediate bond strength, while at T12 bond strength values of the experimental groups are significantly higher compared to the control groups. For the qualitative interfacial nanoleakage analysis, additional molars (4 per group) were selected to evaluate the integrity of the tooth/resin interfaces. The experimental groups were divided as follow: 1) 0.1% riboflavin-XP Bond; 2) 0.3M EDC-Scotch Bond 1XT; 3) 0.3M EDC-Optibond FL. The specimens were prepared and stored as described for the microtensile test; after storage the beams were immersed for 24h in AgNO3, then rinsed in distilled water and immersed in photo-developing solution to reduce silver ions into metallic silver grain. Nanoleakage analysis was performed under light microscopy and the interfacial nanoleakage degree was scored on a scale of 0–4 based on the percentage of the adhesive surface showing silver nitrate deposition: 0: no nanoleakage; 1: <25% nanoleakage; 2: 25 to ≤50% nanoleakage; 3: 50 to ≤75% nanoleakage; and 4: >75% nanoleakage. Statistical differences among nanoleakage group scores were analyzed using the χ2 test. The results did not reveal differences in the interfacial nanoleakage expression between the experimental groups 2 (0.3M EDC-Scotch Bond 1XT) and 3 (0.3M EDC-Optibond FL) and their respective control group. After 12-month storage the treatment with the riboflavin significantly reduce the infiltration of AgNO3 within the hybrid layer created with XP Bond. For the biochemical assay of the enzymatic activity, zymographic analysis and in situ zymography were performed. The following groups were added to the previously described treatments and submitted to these tests: 0.5M DCC/ethanol, 0.5M DCC/acetone, 0.5M DCC/ethanol- Scotchbond 1XT, 0.5M DCC/acetone Scotchbond 1XT. For the zymographic analysis dentin powder was obtained from thirty human sound molars; the powder was treated with the cross-linking agents in association or not with the different adhesive systems. The extract proteins were submitted to electrophoresis on SDS-polyacrylamide gels copolymerized with gelatin as MMPs substrate. Zymograms showed that the use of cross-linkers before the adhesive application was able to reduce or totally inhibit the activity of MMPs (especially MMP-2 and MMP-9). The specimens submitted to in situ zymography were prepared as previous described for the microtensile test. Bonded specimens were cut in order to expose the adhesive/dentin interfaces and in situ zymography was performed applying a self-quenched fluorescein-conjugated gelatin on adhesive/dentin interface. The specimens were light-protected and incubated in humidified chambers at 37°C for 24 h, then the hydrolysis of quenched fluorescein-conjugated gelatin substrate (related to endogenous gelatinolytic enzyme activity) was assessed by examination with a confocal laser scanning microscope. Images revealed reduced green fluorescence in the hybrid layer of experimental groups (pretreated with the cross-linking agents) compared to the control group fluorescence. The results of all these studies suggest that the use of cross-linking agents before the bonding procedures improves the stability of the resin/dentin interface. We can speculated that cross-linkers are able to reinforced the dentin collagen network increasing the mechanical properties of the hybrid layer, as confirmed by the microtensile test. Furthermore the results showed that these agents are able to inhibit the MMP gelatinolytic activity, preserving the dentin collagen fibrils from the hydrolysis and avoiding the failure of the hybrid layer.
L’odontoiatria adesiva si basa sulla capacità delle resine adesive di penetrare all’interno del network del collagene dentinale portando alla formazione del cosiddetto strato ibrido; la stabilità e l’integrità delle fibrille collagene dello strato ibrido sono fondamentali per preservare le caratteristiche dell’adesione al tessuto dentinale nel tempo. È noto che le metallo-proteinasi della matrice (MMPs), enzimi endogeni della dentina, possono causare l’idrolisi e la conseguente degradazione dello strato ibrido dentinale. Scopo del presente progetto di ricerca è stata la valutazione dell’efficacia di diversi agenti cross-linkers del collagene sulla stabilità dell’interfaccia adesivo/dentinale. Inizialmente sono stati testati due diversi agenti cross-linkers, entrambi solubili in acqua: la riboflavina ed il carbodiimide hydrochloride, 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] (EDC), successivamente sono state incluse nello studio altre due sostanze: l’acroleina (solubile in acqua), e il N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (solubile in etanolo o acetone). La concentrazione di ogni soluzione testata è stata scelta in accordo con la letteratura: 0.1% riboflavina/wt, 0.3M EDC/wt, 0,01% acroleina/wt, 0.5M DCC/etanolo, 0.5M/acetone. Gli agenti cross-linkers sono stati testati in associazione a diversi sistemi adesivi disponibili sul mercato. Al fine di valutarne la capacità nella conservazione dello strato ibrido sono state scelte diverse tipologie di analisi: meccanica (microtensile bond strength), qualitativa (analisi del nanoleakage), e biochimiche (zimografia e zimografia in situ). L’analisi meccanica è stata effettuata mediante il test del microtensile per il quale sono stati scelti denti molari umani (5 per gruppo) su cui sono state effettuate le procedure per un restauro adesivo: nei gruppi sperimentali la dentina è stata trattata con l’agente cross-linker scelto prima dell’applicazione del sistema adesivo; nei gruppi controllo gli adesivi (XP Bond, Scotch Bond 1XT, Optibond FL, Clearfil SE) sono stati utilizzati seguendo le istruzioni del produttore. I gruppi sperimentali sono stati suddivisi nel seguente modo: 1) 0.1% riboflavina+XP Bond; 0.3M EDC+Scotch Bond 1XT; 2) 0.3M EDC+XP Bond 3) 0.3M EDC+ScotchBond 1XT; 4) 0.3M EDC+Optibond FL; 5) 0.01% acrolein+ScotchBond 1XT; 6) 0.3M EDC+Clearfil SE. I campioni sono stati poi tagliati per ottenere sticks delle dimensioni di 1 mm circa di spessore in accordo con la “non-trimming technique”. I campioni ottenuti sono stati conservati, in saliva artificiale a 37°C per simulare l’ambiente del cavo orale. Dopo 24 ore (T0), 6 mesi (T6), e 1 anno (T12) i campioni sono stati sottoposti a test di trazione usando una macchina universale alla velocità di 1 mm/min. I dati sono stati analizzati con il test di ANOVA a due vie (trattamento con il cross-linker/tempo di storaggio) e con il post hoc Tukey test (valori di p < 0.05 indicano differenza statisticamente significativa). I risultati del test di microtensile hanno mostrato che il pretrattamento con cross-linkers del collagene non influisce sui valori di adesione a T0, mentre i valori a T12 evidenziano che l’uso dei cross-linkers aumenta significativamente l’adesione rispetto ai rispettivi gruppi controllo. L’analisi qualitativa dell’interfaccia adesiva è stata effettuata mediante valutazione del nanoleakage. A tale scopo, sono stati aggiunti altri 4 molari per ciascun gruppo. I gruppi sperimentali sono stati divisi come segue: 1) 0.1% riboflavina+XP Bond; 2) 0.3M EDC+Scotch Bond 1XT; 3) 0.3M EDC+Optibond FL. I campioni sono stati preparati come precedentemente descritto per il test di microtensile e dopo i medesimi tempi di storaggio i campioni sono stati immersi in una soluzione acquosa di nitrato di argento (AgNO3) per 24 ore, sciacquati, e successivamente immersi in liquido di sviluppo al fine di ridurre gli ioni di argento. I campioni sono stati quindi analizzati al microscopio ottico, ed il nanoleakage è stato quantificato con valori da 0 a 4, basandosi sulla percentuale di superficie dello strato ibrido infiltrata dal nitrato d’argento, come segue: 1: <25% nanoleakage; 2: 25 a ≤50% nanoleakage; 3: 50 a ≤75% nanoleakage; and 4: >75% nanoleakage. I dati sono stati analizzati utilizzando il χ2 test. I risultati mostrano differenze significative a T12 solo per il gruppo 1 (0.1% riboflavina-XP Bond), in cui il gruppo sperimentale trattato con agente cross-linkers presenta all’interno dello strato ibrido una minore quantità di AgNO3 se comparato al gruppo controllo. Al contrario gli altri due cross-linkers presi in analisi non hanno mostrato differenze statisticamente significative in relazione al loro uso a T0 o T12. In relazione ai tests biochimici, sono state effettuati test si zimografia e la zimografia in situ al fine di valutare l’attività enzimatica delle MMPs dentinali in relazione al trattamento con agenti cross-linkers. Ai gruppi precedentemente testati sono stati aggiunti ulteriori 4 gruppi sperimentali: 0.5M DCC/etanolo, 0.5M DCC/acetone, 0.5M DCC/etanolo-Scotchbond 1XT, 0.5M DCC/acetone-Scotchbond 1XT. Per la zimografia sono stati scelti trenta molari sani dai quali è stata isolata la dentina e polverizzata. La polvere di dentina è poi stata trattata con i diversi cross-linkers e adesivi come precedentemente descritto. Le proteine estratte dalla polvere dentinale, trattata secondo i diversi gruppi di appartenenza, sono state quindi sottoposte a corsa elettroforetica su gel di SDS-page co-polimerizzato con gelatina, come substrato delle MMPs. I gels ottenuti mostrano che il trattamento della dentina con agenti cross-linker prima dell’applicazione degli adesivi dentinali è in grado di diminuire o inibire quasi completamente l’attività gelatinolitica delle MMPs (MMP-2 -9 in particolare). Per quanto riguarda la zimografia in situ i campioni sono stati preparati come descritto per il test di microtensile, successivamente sono stati tagliati in modo da esporre l’interfaccia adesiva. A livello della stessa interfaccia è stata posta della gelatina coniugata con fluorescina. L’idrolisi della gelatina causata dagli enzimi endogeni dentinali determina l’attivazione della fluorescenza evidenziando quindi in situ l’attività enzimatica. I campioni sono stati osservati mediante microscopio confocale ed hanno evidenziato una minore fluorescenza all’interno dello strato ibrido di tutti gruppi sperimentali presi in analisi se confrontate con i rispettivi gruppi controllo. In conclusione possiamo affermare che l’uso degli agenti cross-linkers del collagene prima delle procedure adesive migliora le caratteristiche generali dello strato ibrido. È possibile suppore che i cross-linkers siano in grado di rinforzare il network del collagene dentinale aumentandone le proprietà meccaniche, come dimostrato dal test del microtensile; inoltre i tests enzimatici mostrano come questi agenti siano in grado di inibire l’attività enzimatica delle MMPs preservando in questo modo l’idrolisi delle fibrille collagene ed evitando la conseguente disgregazione dello strato ibrido.
Ciclo di dottorato: XXVII Ciclo
metadata.dc.subject.classification: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NANOTECNOLOGIE
Description: 2013/2014
Keywords: cross-linkers
sistemi adesivi dentinali
dentin bonding adhesive system
MMPs
zymography
microtensile bond strength
in situ zymography
zimografia,
zimografia in situ
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: MED/28 MALATTIE ODONTOSTOMATOLOGICHE
NBN: urn:nbn:it:units-15107
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