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Title: Resistenza al linezolid e ai glicopeptidi in enterococchi isolati a Trieste
Authors: Cian, Franca
Keywords: Linezolid-resistenza, Enterococcus faecalis, VLRE, Enterococcus faecium, MRSA, resistenza alla vancomicina, Lin-screen
Issue Date: 2-Mar-2009
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Il problema della comparsa e propagazione veloce delle antibiotico-resistenze in ambiente ospedaliero, ma anche extraospedaliero, è divenuto ormai un’emergenza che solo un’attenta politica sanitaria può aiutare a combattere o quantomeno a contenere. Molti studi a livello nazionale e nell’ambito della comunità europea e internazionale concordano che solo l’uso oculato dei farmaci e l’identificazione immediata delle specie resistenti possono ridurre la diffusione del fenomeno, che attualmente provoca un notevole incremento della spesa sanitaria e un peggioramento della qualità di vita dei pazienti. I dati epidemiologici indicano una grande variabilità geografica delle antibiotico-resistenze, sia a livello di nazioni, che di singole realtà locali o addirittura evidenziano differenze circoscritte a piccole zone ben delimitate e questo rende praticamente impossibile estrapolare linee guida a validità universale, mentre è necessario creare programmi di sorveglianza adattati alla realtà locale delle specie batteriche e delle loro resistenze. L’industria farmaceutica cerca di sopperire alla costante richiesta di farmaci che possono essere efficaci contro le specie resistenti, ma lo studio di nuove molecole attive richiede molti anni e spesso la loro introduzione nell’uso clinico è in breve neutralizzata dai meccanismi di variabilità batterica. Il progetto di ricerca è partito da una prima valutazione della situazione locale, con particolare attenzione a microrganismi che presentassero antibiotico-resistenze con frequenze anomale rispetto ai dati nazionali o internazionali e verso farmaci di recente introduzione. Si è osservato un dato inconsueto per la resistenza degli enterococchi al linezolid, farmaco appartenente ad una nuova classe di antibiotici, gli oxazolidinoni, il cui uso clinico è iniziato in Italia nel 2001. A Trieste nel 2005 si è registrata una frequenza di resistenza (isolati resistenti e a sensibilità intermedia) al linezolid in enterococchi del 5,5% che non ha riscontro nei report periodici dei programmi di sorveglianza internazionali di tale resistenza (ZAAPS, LEADER, SENTRY). Si è valutata dapprima la strategia più idonea per verificare se la resistenza anomala al linezolid (LNZ) fosse reale o fosse dovuta ad una sovrastima delle resistenze prodotta dalle metodologie seguite. Nel 2006 sono stati caratterizzati (identificazione con strumenti automatici o in base a caratteri fenotipici; sensibilità ad antibatterici con metodi automatici o con test di diffusione in agar) e conservati a -80°C enterococchi isolati da tamponi rettali di sorveglianza, eseguiti regolarmente per il monitoraggio delle resistenze nei reparti ad alto rischio di infezioni (Rianimazione e reparti chirurgici), e da altri campioni afferenti al Laboratorio di Microbiologia dell’Ospedale di Cattinara, in particolare enterococchi con resistenza ai glicopeptidi o con dubbia sensibilità al LNZ per un totale di 121 ceppi (114 isolati dai tamponi rettali di sorveglianza e 7 da materiali diversi). Sono state poi valutate le condizioni più idonee per il rilevamento della mutazione G2576T, che conferisce resistenza al linezolid. Questa mutazione comporta il cambiamento di una base nel domain V della subunità 23S dell’rRNA ed è quella predominante in ambiente clinico. In particolare, sono stati valutati i seguenti punti: • Estrazione del DNA: con fenolo/fenolo-cloroformio-isoamilico e successiva precipitazione con etanolo o, metodo più veloce, trattamento a 95° per 10 minuti di una sospensione in 10 µl di acqua distillata di 2-4 colonie prelevate da una coltura on in agar sangue. • Scelta dei primers per l’amplificazione della sequenza di DNA comprendente il sito di mutazione, scelta delle condizioni di amplificazione e identificazione dell’enzima di restrizione più appropriato, NheI, che, in presenza della mutazione G2576T, procede al taglio del frammento di 745 bp ottenuto dall’amplificazione, generando due frammenti di 556 e 189 bp. • Acquisizione di ceppi di controllo resistenti al linezolid: sono stati forniti, dalla Dott.ssa R. Fontana di Verona, 3 ceppi di Enterococcus faecium con diversi gradi di resistenza al LNZ. In nessuno dei ceppi isolati a Trieste nel 2006 è stata rilevata la mutazione G2576T. I ceppi di controllo, sottoposti agli stessi trattamenti di estrazione, amplificazione e restrizione, hanno invece evidenziato il profilo elettroforetico caratteristico generato dalla presenza della mutazione; è stata inoltre rilevata la difficoltà di individuare la resistenza con i test di sensibilità, sia in automazione, sia in agar-diffusione, soprattutto quando solo poche copie di geni sono mutate. Nel maggio del 2007 è stato isolato il primo enterococco resistente ai glicopeptidi e al linezolid (E. faecalis), da un catetere di drenaggio toracico proveniente da un paziente trattato con vancomicina, ma mai con linezolid. Ciò ha dato il via ad una serie di prove per la caratterizzazione del ceppo, per la verifica della presenza della mutazione G2576T e per il controllo dell’eventuale colonizzazione intestinale attraverso colture da tamponi rettali di sorveglianza. Le prove effettuate hanno evidenziato la difficoltà, con i metodi solitamente usati in laboratorio, di isolare i ceppi resistenti in materiali con abbondante flora commensale, come sono i tamponi rettali di sorveglianza; nel materiale fecale possono infatti coabitare enterococchi resistenti e sensibili e una volta cessata la pressione selettiva, determinata dalla terapia, il ceppo sensibile prende il sopravvento su quello resistente, che sarà così difficilmente identificabile, pur mantenendosi spesso vitale e pronto a moltiplicarsi velocemente in caso di ripresa del trattamento, annullando l’efficacia terapeutica del farmaco. Per superare il problema, è stata studiata una apposita strategia, basata sulla coltura dei campioni su terreno selettivo per enterococchi (Enterococcosel agar) e sul successivo inoculo su agar Mueller Hinton contenente 4 µg/ml di linezolid (Lin-screen) di una sospensione densa (2 McFarland) di colonie H2S positive prelevate dall’Enterococcosel. Tale metodo rende possibile la selezione diretta di enterococchi LNZ-resistenti dai tamponi rettali. La sua applicazione ha consentito sia l’isolamento di E. faecalis LNZ-resistente dal tampone rettale del paziente da cui era stato isolato il primo enterococco resistente al linezolid, sia il ritrovamento di un secondo ceppo resistente ai glicopeptidi e al linezolid (E. faecium) in un campione fecale di un paziente in precedenza trattato con linezolid, ma mai sottoposto a terapia con vancomicina. Lo studio si è quindi focalizzato sui ceppi resistenti al linezolid isolati a Trieste, con la ricerca da un lato della storia clinica dei pazienti da cui i ceppi erano stati isolati, dall’altro con la conferma molecolare della presenza della mutazione G2576T e con la genotipizzazione dei ceppi resistenti e sensibili isolati dagli stessi pazienti. È stato inoltre valutata la frequenza della resistenza ai glicopeptidi nel triennio 2006-2008. I principali risultati ottenuti includono: 1) La dimostrazione che il sistema automatico Vitek tende a sovrastimare la resistenza al Linezolid: 9 ceppi di enterococco, la cui MIC per linezolid, determinata dal sistema automatico Vitek, era di 4 µg/ml, indice di sensibilità intermedia (I), sono stati saggiati con Lin-screen e con E-test: non è stata rilevata crescita e la MIC è risultata nel range di sensibilità dimostrando così che il 5,5% di resistenza (ceppi a sensibilità intermedia o resistenti) al linezolid rilevato nel 2005 era quasi certamente frutto di una sovrastima del Vitek. 2) La descrizione del primo caso in Italia di colonizzazione con E. faecalis resistente sia al linezolid che alla vancomicina: il ceppo è stato isolato da un catetere di drenaggio toracico da un paziente trattato con vancomicina per empiema pleurico causato da S. aureus meticillino-resistente (MRSA). La terapia con vancomicina potrebbe aver indotto la possibile selezione dei ceppi vancomicina-resistenti, ma il paziente non è mai stato trattato con linezolid e quindi resta inspiegabile la comparsa di tale resistenza; presenza continua di infezione da MRSA e procedure invasive (cateteri) possono essere fattori di rischio, come forse la contemporanea presenza in reparto di una persona trattata con linezolid. I ceppi resistenti isolati dal catetere e successivamente dai tamponi rettali di sorveglianza presentano il genotipo vanA e appartengono allo stesso clone, ma risultano genotipicamente diversi dai ceppi sensibili isolati dallo stesso tampone di sorveglianza, come rilevato dalla PFGE. Il ceppo resistente potrebbe quindi essere stato acquisito dal personale o dall’ambiente ospedaliero. Il caso è stato presentato con un poster al XXXVII congresso nazionale AMCLI (5-8 ottobre 2008) ed è ora oggetto di un lavoro per l’eventuale pubblicazione su riviste internazionali. 3) La descrizione di E. faecium resistente a vancomicina, teicoplanina e linezolid isolato da un campione di feci, con la tecnica del Lin-screen, in un paziente con pregressa infezione da VRE. Il paziente non è mai stato trattato con vancomicina; è stato trattato con linezolid per un breve periodo e ciò può aver determinato la comparsa dei VLRE. I ceppi resistenti a vancomicina e linezolid, isolati dopo il trattamento con linezolid, sono stati confrontati con gli E. faecium resistenti a vancomicina isolati dallo stesso paziente, prima del trattamento con linezolid: si è valutata sia la presenza della mutazione G2576T (presente solo nei ceppi resistenti al linezolid), sia la relazione clonale tramite PFGE: i ceppi VRE isolati prima del trattamento con linezolid e quelli VRLE colonizzanti appartengono allo stesso clone, quindi in questo caso si può affermare che il ceppo linezolid-resistente è derivato da quello sensibile dopo pressione selettiva data dall’uso, sia pur breve, del linezolid. E’ stata confermata la presenza del gene vanA, tramite amplificazione per PCR, in tutti i ceppi vancomicina-resistenti. 4) L’osservazione che E. faecium vancomicina-resistenti (tutti confermati di genotipo vanA) provenienti da vari reparti ospedalieri, ma anche dall’esterno, sono geneticamente correlati (esame dei profili PGFE dopo macrorestrizione SmaI) e quindi parte della stessa catena di trasmissione; la trasmissione da paziente a paziente o attraverso oggetti contaminati o ancora attraverso gli operatori sanitari potrebbe spiegare la comparsa di VRE anche in pazienti non sottoposti a terapia con glicopeptidi, come nel caso descritto al punto 3. 5) E’ stata infine dimostrata la praticità dell’uso del Lin-screen, la sua capacità di individuare batteri resistenti anche se presenti a bassissime concentrazioni in colture miste ricreate in vitro, i molteplici usi a cui può essere destinato: • Nei pazienti da cui sono stati isolati VLRE dove è necessario esaminare campioni multipli e a distanza di tempo per confermare la scomparsa di enterococchi linezolid-resistenti colonizzanti, infatti non sempre un primo campione negativo basta a confermare la loro assenza, campioni successivi possono nuovamente portare a crescita su Lin-screen, in dipendenza della minore o maggiore concentrazione dei ceppi resistenti e del modo con cui il prelievo è stato eseguito. • Per conferma della sensibilità intermedia o dubbia rilevata da strumenti automatici o dai test di diffusione in agar. • Per eventuali resistenze al linezolid non dovute alla classica mutazione G2576T. • Per il controllo della colonizzazione da parte di ceppi resistenti al linezolid in caso di un eventuale uso del farmaco, esame da eseguire prima dell’inizio della terapia, per escludere la presenza di isolati già in possesso della mutazione e quindi tendenzialmente pronti ad evolvere verso una maggiore resistenza, con il conseguente fallimento terapeutico; esame da ripetere al termine della terapia per confermare l’assenza di ceppi resistenti selezionati in corso di terapia. L’utilizzo del Lin-screen nei 2 casi descritti ha confermato l’ipotesi che VLRE e VLSE possono coabitare in siti normalmente ricchi di flora commensale; in caso di terapia la specie resistente potrà facilmente prendere il sopravvento, moltiplicandosi e diffondendosi in altri siti organici dello stesso paziente o, tramite oggetti contaminati od operatori sanitari o dagli stessi pazienti infetti, passare ad altri pazienti, se non vengono seguite attente procedure di prevenzione e di controllo delle infezioni.
Description: 2007/2008
URI: http://hdl.handle.net/10077/3040
NBN: urn:nbn:it:units-7366
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