Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/3074
Title: Insight into the temporial evolution of spontaneous Ca2+ signals generated by ventral neurons during spinal cord maturation in vitro
Authors: Sibilla, Sara
Supervisore/Tutore: Ballerini, Laura
Issue Date: 27-Mar-2009
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: 
Nel midollo spinale lo sviluppo in circuiti funzionali delle reti neuronali
dell’area ventrale è un processo complesso, che coinvolge meccanismi genetici ed
epigenetici che promuovono la maturazione del controllo motorio (Jessell, 2000;
Kiehn, 2006). Far luce su tali meccanismi è un passo cruciale per identificare quei
neuroni che risultano essere più vulnerabili in caso di patologie degenerative del
midollo spinale, ma anche per elaborare nuove strategie nel campo della
rigenerazione dei circuiti danneggiati.
Le colture organotipiche ottenute dal midollo spinale embrionale di topo e
mantenute in vitro per 1 o 2 settimane, riepilogano molti dei processi che
caratterizzano lo sviluppo dei segmenti spinali in vivo e sono particolarmente adatte
allo studio della maturazione della rete spinale (Avossa et al., 2003; Rosato-Siri et
al., 2004; Furlan et al., 2005; Furlan et al., 2007).
In questa tesi ho usato tale modello per studiare, nei segmenti di midollo
spinale embrionale, il controllo spazio-temporale di segnali intracellulari al Ca2+,
generati da popolazioni neuronali appartenenti ai circuiti motori.
Ho osservato la presenza di segnali ripetuti al Ca2+ dipendenti dall’età delle
colture, monitorando le dinamiche intracellulari del Ca2+ nelle singole cellule con
esperimenti di Ca2+-imaging in fettine precedentemente incubate con la sonda
fluorescente FURA2-AM. Ho analizzato piccoli gruppi di interneuroni localizzati
nella regione ventrale del midollo spinale, a stadi sia precoci che tardivi di sviluppo
della rete, cioè a 7-11 (prima settimana) e 14-17 (seconda settimana) giorni in vitro
(DIV; Furlan et al., 2007).
Per la prima volta ho descritto un cambiamento nella generazione di segnali
spontanei al Ca2+, dipendente dalla maturazione in vitro delle colture: da waves
precoci, guidate dall’attività sinaptica, che invadevano l’intera regione ventrale del
midollo spinale, fino a tardive oscillazioni asincrone, indipendenti dall’attività
elettrica, generate da pochi neuroni ristretti alle aree ventrali.
Mediante marcature di immunofluorescenza nonché con esperimenti di Ca2+-
imaging, ho dimostrato che solo una minoranza (dal 15 al 20 %) di neuroni presenti
nelle zone ventrali esprimevano questa tardiva attività oscillatoria. Queste
oscillazioni mostravano una specifica dipendenza dalle proprietà di buffering del
Ca2+ presenti a livello mitocondriale (Fabbro et al., 2007).
In seguito, ho valutato il ruolo che le fonti extracellulari e intracellulari di
Ca2+ potevano avere nella generazione di queste oscillazioni indipendenti dall’attività
elettrica. Una prima idea del fatto che tali oscillazioni avessero un’origine complessa,
Abstract
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derivava dall’osservazione che nella maggior parte delle cellule (60%), questi segnali
erano completamente bloccati in una soluzione priva di Ca2+, mentre nel 40% dei
neuroni alcune oscillazioni persistevano anche in assenza di Ca2+. Questa risposta in
una soluzione priva di Ca2+ è risultata essere bimodale, dal momento che non ho mai
riscontrato alcuna coesistenza di questi due fenomeni nella stessa fettina. Una simile
eterogeneità è stata osservata anche in seguito ad applicazioni di tapsigargina, la
quale induceva sia il blocco (62% di neuroni) che la persistenza (38%) delle
oscillazioni. Questa attività oscillatoria non dipendeva, però, dai depositi
intracellulari di Ca2+ sensibili alla rianodina.
Così, nonostante le proprietà stereotipate delle oscillazioni (origine,
periodicità, etc…), questi eventi potrebbero essere generati grazie al contributo di
diverse fonti di Ca2+.
Una seconda questione importante nell’identificazione dei neuroni oscillanti è
stata quella di monitorare i pattern di espressione delle Ca2+ binding proteins e dei
trasportatori del Cl-, KCC2 e NKCC1.
Ho osservato una forte dipendenza del profilo di espressione della proteina
calbindina in relazione alla maturazione dei circuiti ventrali durante lo sviluppo.
Questo non era, però, un fenomeno universale, infatti, altre Ca2+ binding proteins,
come calretinina e parvalbumina, non avevano lo stesso profilo di espressione.
Non ho, invece, riscontrato differenze nell’espressione della proteina NKCC1
tra 1 e 2 settimane in coltura; al contrario KCC2, andando avanti con lo sviluppo, si
trovava maggiormente localizzata nei processi neuronali.
Risultati recenti dimostrano che l’H2O2 è un donatore endogeno di specie
reattive dell’ossigeno, presente nel CNS in concentrazioni μM (Lei et al., 1998). Nel
midollo spinale post-natale l’H2O2 è stata recentemente indicata anche come un
mediatore solubile dipendente dal Ca2+ intracellulare, capace di modulare la plasticità
sinaptica in condizioni sia fisiologiche che patologiche (Takahashi et al., 2007).
In questo mio studio, concentrazioni fisiologiche di H2O2 aumentavano il
livello basale del Ca2+ intracellulare solo nei neuroni che oscillavano, senza però
cambiare il periodo delle oscillazioni. Il fatto che i neuroni oscillanti fossero le sole
cellule che rispondevano a basse dosi di H2O2 ci ha suggerito che questi interneuroni
spinali potrebbero essere dei critici trasduttori dell’azione modulatoria dell’H2O2.
In questo modo, un piccolo gruppo di interneuroni ventrali (a 2 settimane di
crescita in vitro) potrebbe essere caratterizzato da due marcatori funzionali: la
sensibilità all’ H2O2 e la capacità di produrre oscillazioni spontanee.
Sembra molto interessante supporre che le periodiche oscillazioni al Ca2+ e la
sensibilità all’H2O2 conferiscano a queste cellule la capacità di modellare la plasticità
dei circuiti locali attraverso differenti cambiamenti (fasici o tonici) nella
concentrazione del Ca2+ intracellulare.

The development of ventral spinal networks into functional circuits is a
complex process comprising genetic and epigenetic mechanisms cooperating for the
maturation of motor control (Jessell, 2000; Kiehn, 2006). Elucidating such a process
is crucial in modern neuroscience to identify neurons more vulnerable to spinal
degenerative disease or to develop novel strategies for rebuilding damaged circuits.
Organotypic cultures developed from embryonic mouse spinal cord, maintained in
vitro for 1 or 2 weeks, recapitulate many events of the in vivo developing spinal
segments and are particularly suited to study spinal network maturation (Avossa et
al., 2003; Rosato-Siri et al., 2004; Furlan et al., 2005; Furlan et al., 2007).
In this thesis, I used such a model to investigate, in embryonic spinal
segments, the spatio-temporal control of intracellular Ca2+ signaling generated by
neuronal populations in motor circuits.
I investigated the age-dependent expression of repetitive Ca2+ signals
monitoring, by Ca2+-imaging technique, neuronal Ca2+ dynamics at single cell level
in slice cultures of the embryonic mouse spinal cord, loaded with the fluorescent
indicator FURA2-AM. I analyzed small groups of ventral spinal neurons at early and
late embryonic network developmental stages, namely at 7-11 (1 week) and 14-17 (2
weeks) days in vitro (DIV; Furlan et al., 2007).
I reported, for the first time, the developmentally-regulated shift in the
generation of repetitive Ca2+ signals, from early waves driven by synaptic activity
invading the entire spinal region to late, activity-independent, asynchronous
oscillations generated by few neurons in restricted ventral areas.
I demonstrated by immunofluorescence stainings and Ca2+-imaging
experiments, that only a minority (15 to 20 %) of ventral neurons expressed this late
Ca2+ oscillatory activity. Such oscillations expressed a specific dependence on
mitochondria Ca2+ buffering properties (Fabbro et al., 2007).
Next, I addressed the role of the extracellular and intracellular Ca2+ sources in
the generation of activity independent oscillations. A first glimpse about the complex
origin of Ca2+ for oscillations came from the observation that, in the majority of cells
(60%), oscillations were completely abolished by Ca2+-free solution, whereas in 40%
of cells clusters of oscillations were still detected during Ca2+-free perfusion. This
response to Ca2+-free medium was bimodal, as no coexistence of these two effects
was found in the same slice. Similar heterogeneity was observed following the
application of the Ca2+ stores depletory, thapsigargin that induced either block (62%
of neurons) or persistence (38%) of oscillations. The oscillatory activity was not
dependent on ryanodine-sensitive stores.
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Thus, despite the stereotyped properties of oscillations (origin, periodicity,
etc), these events could be generated with the contribution of multiple Ca2+ sources.
A second issue relevant in identifying oscillating neurons was to monitor the
patterns of expression of Ca2+ binding proteins and of Cl- co-transporters, KCC2 and
NKCC1.
I observed a strong dependence of the expression profile of the Ca2+-binding
protein calbindin on developmental maturation. This was not an universal
phenomenon, in fact, other Ca2+ binding proteins, such as calretinin and
parvalbumin, did not follow the same pattern.
I did not detect differences in the expression pattern of NKCC1, between 1
and 2 weeks of in vitro growth, conversely KCC2-ir was more located to neuronal
processes along with development.
Recent results show that H2O2 is an endogenous donor of reactive oxygen
species present in the CNS in μM concentrations (Lei et al., 1998). In the postnatal
spinal cord, H2O2 has been recently indicated as a soluble, Ca2+ dependent mediator,
capable of modulating synaptic plasticity under physiological and pathological
conditions (Takahashi et al., 2007).
In this study, physiological concentrations of H2O2 increased intracellular
Ca2+ only in oscillating neurons without changing the oscillation period. The fact that
oscillating neurons were the only responsive cells to a low H2O2 dose suggested that
these spinal interneurons could be critical transducers of the modulatory action of
H2O2.
Thus, a small group of ventral interneurons (at 2 weeks in vitro) could be
characterized by two functional predictors, namely sensitivity to H2O2 and ability to
produce spontaneous oscillations.
It seems attractive to assume that periodic oscillations of Ca2+ plus H2O2
sensitivity confer a summative ability to these cells to shape the plasticity of local
circuits through different changes (phasic or tonic) in intracellular Ca2+.
Ciclo di dottorato: XXI Ciclo
metadata.dc.subject.classification: NEUROSCIENZE
Description: 
2007/2008
Keywords: spinal cord
development
organotypic cultures
Ca2+ signalling
H2O2
Ca2+-imaging
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: BIO/09 FISIOLOGIA
NBN: urn:nbn:it:units-7403
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