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Title: Enzymes as catalysts in polymer chemistry
Authors: Sinigoi, Loris
Supervisore/Tutore: Gardossi, Lucia
Issue Date: 8-Apr-2011
Publisher: Università degli studi di Trieste
The use of enzymes in synthetic chemistry is attracting the interest of many researchers thanks to their extraordinary efficiency under mild conditions, high stereo- regio- and chemoselectivity and low environmental impact. Their application in the field of polymer chemistry has provided new synthetic strategies for useful polymers. The advantages coming from the use of enzymes are mainly: i) the possibility to synthesize polymers with novel properties and difficult to produce by conventional chemical catalysts; ii) the improvement of the synthetic processes in terms of sustainability, for instance by avoiding toxic catalysts.
In particular hydrolases have demonstrated to be efficient catalysts in the development of highly structured polyesters with low polydispersity characterized by the presence of different functionalisations. Although generally the enzymatic processes lead to the formation of oligomers of limited Mn, these can be successively chemically polymerized to synthesize new innovative products with high Mn. Hydrolases enzymes offer also a great opportunity for using non-petrochemical renewable resources as starting substrates thus contributing to global sustainability of polymerization processes.
Also oxidases have proven to be efficient catalysts in polymer chemistry thanks to their capability to catalyze oxidation of phenolic groups. This radicalic reaction can be exploited either for: i) degrading lignin; ii) functionalizing lignin phenolic moieties thus improving their chemical and physical properties; iii) polymerize phenol derivatives or phenol based oligomers.
Unfortunately, the use of enzymes in polymer chemistry on industrial scale is still hindered by many factors among which the most significant are: i) the instability of many commercial immobilized preparations under process conditions, ii) the high costs of both the biocatalyst and the monomers from renewable resources and iii) the limited availability of information concerning the main factors which affect the scalability and the industrialization of this kind of enzymatic processes.
At this regard, the work described in Chapter 2 of the thesis exploits the catalytic potential of lipase B from Candida antarctica in polymerization processes. In collaboration with the group of Professor Karl Hult (KTH “Royal Institute of Technology”, Stockholm) a new synthetic route for the enzymatic synthesis of new innovative highly structured allyl functionalized polyester of industrial interest has been developed. Finally, products obtained have been efficiently employed in thiol-ene chemistry for films production.
Chapter 3 deals with the synthesis of functionalized polyesters starting from renewable feedstock which can be employed as new starting materials for the production of surfactants for cosmetic and pharma industry. Continuing on the study of lipase catalyzed polyester synthesis, in Chapter 4 particular attention has been given to the feasibility of the biocatalysed technology at industrial level, namely addressing the problem of biocatalyst’s stability and formulation. In particular a highly stable covalently immobilized preparation of CALB, developed in collaboration with SPRIN Technologies, has been exploited for the synthesis of polyesters demonstrating the advantages coming from covalent immobilization over the other commercially available CALB adsorbed preparations, namely higher recyclability and absence of enzyme leaching. On this respect, one-step and multistep processes for the synthesis of polyesters employing adipic acid and 1,4-butanediol have been the subject of a deep investigation. A comparative analysis describes the effect of enzyme leaching from adsorbed preparations during polycondensation reactions evidencing meanwhile the stability of the covalent enzymatic preparation under harsh conditions. Within the context of this study characterization of the synthesized polymers has been feasible thanks to the collaboration with the group of Dr. Mario Malinconico at the “Istituto di Chimica e Tecnologia dei Polimeri” ICTP-CNR, Pozzuoli (NA). Moreover, a new methodology for polymer characterization which integrates DOSY NMR and GROMACS simulation techniques has been developed in collaboration with CBM (“Cluster in Biomedicine”, Area Science Park, Trieste). The obtained results open new perspectives for the study of polymer behavior in specific media.
The final part of the work (Chapter 5) focuses on the potential applicability of laccases under non-conventional conditions, thus exploring new routes for more efficient lignin degradation. The most important obstacle to technological and commercial application of laccases is the limited number of enzymes readily available for industrial applications. At this regard, thanks to the collaboration with the group of Prof. Ludmila Golovleva (Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, “Russian Academy of Science”, Puschino, Russia), we have studied the stability and activity of three different fungal laccases in the conditions of interest for lignin processing, namely in organic/buffer mixtures and under microwaves radiation. The proof of concept for the application of the considered laccases in lignin valorization has been demonstrated assessing lignin over laccases mediated oxidation in organic/buffer mixtures media. Moreover, a laccase endowed with remarkable higher stability as compared to the other tested has been identified. The enzyme is currently under study for understanding the structural basis of its stability.
In conclusion, the work of this thesis demonstrates that the lipase catalyzed synthesis of polyesters is a mature technology ready to be employed at industrial scale for those specific applications where the chemical properties of products or the sustainability of the process represent crucial issues in the classical chemical processes. Moreover, the new properties of the immobilized lipase employed in the present study induce to believe that the problem of biocatalyst stability and recyclability has been finally overcome.
Concerning the application of laccases, the valorization of lignin in terms of production of bio-based chemicals is still a very new field of research, although it is expected to become one of the major topics for the future development of the “Sustainable Chemistry”.1 The present study intends to be a contribution for the identification of suitable biocatalysts and more efficient conditions for the degradation and modification of one of the most abundant biopolymers in Nature. The high stability of the laccase here reported induces to pursue in their characterization under non-conventional reaction conditions on different types of lignin.
1 J. E. Holladay, J. J. Bozell, J. F. White, D. Johnson, “Top Value-Added Chemicals from Biomass”, 2007, U.S. Department of Energy.(

L'impiego di enzimi nella chimica di sintesi sta attirando l'interesse di molti ricercatori, ciò è dovuto in
particolare alla loro straordinaria efficienza in condizioni di reazione blande, alla loro elevata stereo-,
regio- e chemoselettività e al loro basso impatto ambientale. L’ applicazione di biocatalizzatori nel
campo della chimica dei polimeri ha fornito nuove strategie sintetiche per lo sviluppo di materiali
innovativi. I principali vantaggi derivanti dall'impiego di enzimi sono: i) la possibilità di sintetizzare
polimeri con nuove proprietà e difficili da ottenere mediante processi chimici convenzionali ed ii) il
miglioramento dei processi di sintesi in termini di sostenibilità ambientale evitando l’impiego di
catalizzatori tossici.
Le idrolasi in particolare hanno dimostrato di essere catalizzatori efficienti per lo sviluppo di poliesteri
altamente strutturati e a bassa polidispersità, caratterizzati inoltre dalla presenza di varie
funzionalizzazioni chimiche terminali. Anche se generalmente i processi enzimatici portano alla
formazione di oligomeri a basso peso molecolare, questi possono essere successivamente polimerizzati
chimicamente per formare nuovi prodotti innovativi ad alto Mn. Le idrolasi offrono inoltre
l’opportunità di impiegare monomeri provenienti da risorse rinnovabili contribuendo così alla
sostenibilità ambientale dei processi di polimerizzazione.
Anche le ossidasi hanno dimostrato di essere catalizzatori efficienti e facilmente impiegabili nella
chimica dei polimeri grazie alla loro capacità di catalizzare l'ossidazione radicalica di gruppi fenolici.
Queste reazioni radicaliche possono trovare diverse applicazioni come ad esempio: i) nella
degradazione della lignina; ii) nella funzionalizzazione dei gruppi fenolici della lignina che consentano
di migliorarne le proprietà chimiche e fisiche; iii) nella polimerizzazione di derivati fenolici o di
oligomeri a base di fenolo.
Sfortunatamente, l'impiego di enzimi su scala industriale è ancora ostacolato da una serie di fattori tra i
quali i più significativi sono: i) l'instabilità delle preparazioni enzimatiche commercialmente disponibili
nelle condizioni di processo, ii) gli alti costi del biocatalizzatore e dei monomeri provenienti da risorse
rinnovabili e iii) la limitata disponibilità di informazioni riguardanti i principali fattori che influenzano
la scalabilità e l'industrializzazione di questo tipo di processi enzimatici.
A questo proposito, il lavoro descritto nel capitolo 2 di questa tesi sfrutta le potenzialità catalitiche
della lipasi B da Candida antarctica nei processi di polimerizzazione. In particolare è stata sviluppata,
in collaborazione con il gruppo del prof. Karl Hult (KTH “Royal Institute of Technology”, Stoccolma),
una nuova via sintetica biocatalizzata per la produzione di poliesteri innovativi altamente strutturati
recanti funzionalizzazione allilica, che trovano ampia applicabilità industriale. I prodotti così ottenuti
sono stati successivamente impiegati con successo nella chimica dei tioleni per la produzione di films.
Il capitolo 3 è invece dedicato alla sintesi di poliesteri funzionalizzati a partire da materie prime
rinnovabili; i prodotti così sviluppati trovano potenziale applicazione come tensioattivi per l'industria
cosmetica e farmaceutica.
Proseguendo lo studio della sintesi biocatalizzata di poliesteri, nel capitolo 4 particolare attenzione è
stata data alla fattibilità dei processi biocatalizzati a livello industriale affrontando il problema della
stabilità del biocatalizzatore. In particolare, una preparazione di CALB immobilizzata covalentemente
su supporti polimerici, sviluppata in collaborazione con SPRIN Technologies, è stata impiegata nella
sintesi di poliesteri dimostrando i vantaggi dovuti all’ immobilizzazione covalente rispetto alle altre
preparazioni adsorbite commercialmente disponibili, ovvero l’elevata riciclabilità del biocatalizzatore e
la mancanza di rilascio di enzima nel prodotto finale. A tal proposito, la sintesi one-step e multistep di
poliesteri a partire da acido adipico e 1,4-butandiolo è stata oggetto di una profonda indagine. Il lavoro
riporta un' analisi comparativa che descrive l'effetto del rilascio dell’ enzima durante le reazioni di
policondensazione evidenziando nel contempo la straordinaria stabilità della preparazione enzimatica
covalente. La caratterizzazione dei polimeri così ottenuti è stata possibile grazie alla preziosa
collaborazione con il gruppo del Dott. Mario Malinconico (Istituto di Chimica e Tecnologia dei
Polimeri "ICTP-CNR, Pozzuoli (NA)).
Al termine del capitolo 4 è stata sviluppata, in collaborazione con CBM ("Cluster in Biomedicine",
Area Science Park, Trieste), una nuova metodologia per la caratterizzazione dei polimeri che integra
DOSY NMR e tecniche di simulazione GROMACS. I risultati ottenuti da questo lavoro aprono nuove
prospettive per lo studio del comportamento dei polimeri in solventi organici.
La parte finale del lavoro di tesi (capitolo 5) si concentra sull’ applicabilità di laccasi in condizioni non
convenzionali, esplorando nuove vie per i processi di degradazione della lignina. Il principale ostacolo
nell’impiego tecnologico delle laccasi su scala industriale è il limitato numero di enzimi
commercialmente disponibili per tali applicazioni. A questo proposito, grazie alla collaborazione con il
gruppo della Prof.ssa Ludmila Golovleva (Istituto di Biochimica e Fisiologia dei Microorganismi,
"Russian Academy of Science", Puschino, Russia), è stato possibile studiare la stabilità e l'attività di tre
diverse laccasi fungine nelle condizioni di interesse per la trasformazione della lignina, vale a dire in
miscele di solvente organico e sotto irradiazione di microonde. L’applicabilità delle laccasi considerate
nella valorizzazione della lignina è stata dimostrata valutando l’ ossidazione della lignina nelle
condizioni di interesse. E’stata quindi identificata una laccasi caratterizzata da una stabilità
particolarmente elevata, l' enzima è attualmente in studio per la comprensione delle basi strutturali che
gli conferiscono tali caratteristiche.
In conclusione, questo lavoro di tesi dimostra che la sintesi di poliesteri CALB catalizzata è una
tecnologia matura, pronta per essere impiegata su scala industriale laddove le proprietà chimiche dei
prodotti o la sostenibilità ambientale del processo rappresentano ostacoli non sormontabili impiegando
le calssiche metodologie sintetiche. Inoltre l’elevata stabilità della lipasi immobilizzata
covalentemenete induce a credere che il problema della stabilità del biocatalizzatore e di conseguenza
del suo riciclaggio è stato definitivamente superato.
L'applicazione delle laccasi nella valorizzazione della lignina per lo sviluppo di prodotti chimici biobased
è un campo di ricerca relativamente nuovo ma destinato a diventare uno dei settori più importanti
per lo sviluppo della "chimica sostenibile".1 Il presente studio intende essere un contributo per
l'identificazione del biocatalizzatore e delle condizioni di reazione più adatte per la degradazione e la
trasformazione della lignina, uno dei biopolimeri più abbondanti presenti in natura. L’elevata stabilità
della laccasi identificata in questo lavoro induce inoltre a proseguire con gli studi di applicabilità di
questo enzima in mezzi non convenzionali.
1 J. E. Holladay, J. J. Bozell, J. F. White, D. Johnson, “Top Value-Added Chemicals from Biomass”, 2007, U.S. Department
of Energy.)
Ciclo di dottorato: XXIII Ciclo
Keywords: Biocatalysis
Lipase CALB
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: CHIM/06 CHIMICA ORGANICA
NBN: urn:nbn:it:units-9002
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