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Title: Toxicological effects of palytoxin after cutaneous exposure
Authors: Pelin, Marco
Supervisore/Tutore: Tubaro, Aurelia
Cosupervisore: Florio, Chiara
Issue Date: 17-Apr-2012
Publisher: Università degli studi di Trieste
Palytoxin (PLTX) is a marine toxin identified in Palythoa zoanthid corals and Ostreopsis dinoflagellates, representing an increasing hazard for human health. Human poisonings attributed to PLTX exposure are usually associated to ingestion of contaminated seafood and to marine aerosol exposure during Ostreopsis blooms. However, also dermatological problems have been recently associated to PLTX cutaneous exposure during Ostreopsis blooms as well as after handling of Palythoa corals. Despite the increasing human cases of dermotoxicity attributed to PLTX, very few data about its dermal toxicity are presently available. Hence, the aim of this study is to investigate the cutaneous effects of PLTX characterizing its mechanism of action. Thus, this toxicological in vitro study has been carried out on spontaneously immortalized human keratinocytes (HaCaT cells), as a first-round screening of dermotoxicity.
The entity of cytotoxicity induced by PLTX has been firstly investigated. A short time exposure (4 h) to PLTX reduces mitochondrial activity (MTT assay), cell mass (SRB assay) and plasma membrane integrity (LDH leakage) with different potencies (EC50 values of 6.1±1.3x10-11, 4.7±0.9x10-10 M and 1.8±0.1x10-8 M, respectively). All these effects are ouabain-sensitive corroborating the dependency of PLTX effects on the interaction with Na+/K+-ATPase. These results indicate that among the chain of intracellular events following the interaction of PLTX with the Na+/K+-ATPase the earliest is mitochondrial damage. This sustained cytotoxic effect can be explained by the high affinity of binding to HaCaT cells. Indeed, saturation experiment reveals a Kd affinity constant of 3.0±0.4x10-10 M after an exposure time as short as 10 minutes.
A possible mechanism of mitochondrial dysfunction can be reactive oxygen species (ROS) overproduction. Among all, only superoxide anion (O2-) seems to be produced by the toxin after only 1 h, whereas neither nitric oxide nor peroxynitrite formation are detected. Hence, the mechanism of O2- production has been investigated. Real time PCR analysis together with western blot analysis suggest a possible involvement of NADPH oxidase (NOX) and inducible nitric oxide synthetase (iNOS) since an early increase of their gene and protein expression was observed after short (1 – 4 h) but not longer (24 h) exposure times. On the contrary, other enzymes involved in ROS production (i.e. COX-1, COX-2, XOD) seem to be not involved in PLTX effects. Moreover, using selective inhibitors of these enzymes, we found that only DPI, a nonspecific inhibitor of both NOX and NOS, is able to inhibit by 15%, 26% and 43% O2- production induced by 10-10, 10-9 and 10-8 M PLTX, respectively. However, NMMA, inhibitor of NOS, significantly reduces only O2- produced by high (10-8 M) but no by low (10-9 and 10-10 M) PLTX concentrations, whereas the selective inhibitor of NOX apocynin is totally ineffective. Moreover, since their co-administration does not reproduce DPI effect, a prominent role of these enzymes in causing PLTX-induced oxidative stress seems unlikely. Another feasible source of O2- is mitochondria itself and its production is regulated by H+ fluxes through mitochondrial membranes. Indeed, in presence of nigericin, an ionophore that reduces the H+ imbalance, PLTX-induced O2- is significantly reduced by 23% (10-9 M PLTX) and 24% (10-8 M PLTX). Furthermore, the co-administration with rotenone, a complex I inhibitor, that per se is ineffective, results in a further inhibition of O2- production (-32% and -43% in the presence of 10-9 and 10-8 M PLTX, respectively). Moreover, O2- production turned out to be ouabain-sensitive and Na+-dependent but Ca2+-independent. Thus, on the basis of these results it has been hypothesized that PLTX binding to Na+/K+-ATPase induces intracellular overload of Na+ followed by intracellular increase of H+ with a consequent ΔpH increase across H+-impermeable mitochondrial inner membrane and O2- overproduction by reverse electron transports through mitochondrial chain.
Under oxidative stress conditions, mitochondrial dysfunction can be mediated by mitochondrial permeability transition pore (MPTP), which opening, indeed, is induced by PLTX already after only 5 minutes exposure. MPTP opening, which turned out to be cyclosporine A-independent, seems to be mainly induced by the sustained ionic imbalance, since in Na+-free, Ca2+-free medium and in presence of nigericin PLTX effect is strongly inhibited. The very rapid Na+-dependent opening of MPTP suggests that this is the peculiar mechanism of PLTX cytotoxicity and cell death primum movens. Cell death induced by the toxin seems to occur with necrotic-like features. PLTX, indeed, induces a concentration- and time-dependent as well as irreversible uptake of PI after only 1 h exposure and confocal images revealed dramatic morphological alterations such as plasma membrane ruptures and leakage of cytolpasmic content after 4 h. By contrast, caspasis 3/7, 8 and 9 are not activated by PLTX up to 24 h, neither under recovery conditions. Moreover, apoptotic bodies formation is not observed, discarding apoptosis occurrence.
Finally, PLTX effects on some pro-inflammatory mediators such as cytokines (IL-1α, IL-6, IL-8 and TNF-α) and arachidonic acid metabolism products (PGE2 and LTB4) have been evaluated. The toxin (10-11 M) induces an early release of PGE2 that is time-dependent after 2 h exposure. On the contrary, even if an early gene expression (1–4 h) is observed, the toxin induces a delayed release of IL-6 and IL-8 (24 h), whereas no effects have been observed evaluating IL-1α and TNF-α.
In conclusion, this study highlights the toxic in vitro properties of PLTX on human keratinocytes. The intracellular pathway of the sustained PLTX cytotoxicity leading to cell death has been characterized, as well as the inflammatory mediators involved in skin irritant properties of the toxin. These results can corroborate the use of non steroidal anti-inflammatory drugs in association with anti-inflammatory corticosteroids.

La palitossina (PLTX) è una tossina marina identificata in coralli zoantidi appartenenti al genere Palythoa e dinoflagellati del genere Ostreopsis. Intossicazioni umane attribuite alla PLTX sono state solitamente associate all'ingestione di prodotti ittici contaminati, nonché da un'esposizione ad aerosol marino durante le fioriture di Ostreopsis. Tuttavia, anche problemi dermatologici sono stati recentemente associati alla PLTX in seguito ad esposizione cutanea durante fioriture di Ostreopsis o manipolando coralli Palythoa. Nonostante i crescenti casi di dermotossicità attribuiti alla PLTX, pochissimi dati sulla sua tossicità cutanea sono attualmente disponibili. Lo scopo di questo studio è stato, pertanto, indagare gli effetti cutanei della PLTX caratterizzando il suo meccanismo d'azione. E’ stato quindi effettuato uno studio tossicologico in vitro su cheratinociti umani spontaneamente immortalizzati (cellule HaCaT), considerate metodo predittivo per uno screening preliminare di dermotossicità.
In primo luogo è stato caratterizzato il grado di citotossicità indotta dalla tossina. Un breve tempo d'esposizione (4 h) alla PLTX riduce l'attività mitocondriale (saggio MTT), la massa cellulare (saggio SRB) e l'integrità della membrana plasmatica (perdita LDH) con diversi valori di EC50 (6.1 ± 1.3x10-11, 4.7 ± 0.9x10-10 M e 1.8 ± 0.1x10-8 M, rispettivamente). Tutti questi effetti sono sensibili alla ouabaina, corroborando la dipendenza degli effetti della PLTX sull'interazione con la Na+/K+-ATPasi. Questi risultati indicano che fra la catena di eventi intracellulari dopo l'interazione con l’ATPasi il più sensibile è un danno mitocondriale. Questo effetto può essere spiegato dall’alta affinità di legame della tossina con le cellule HaCaT. Infatti, esperimenti di saturazione rivelano una costante di affinità (Kd) pari a 3,0 ± 0.4x10-10 M dopo un tempo di esposizione molto breve (10 minuti).
Uno dei possibili meccanismi di disfunzione mitocondriale è una sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Tra tutti, solo l’anione superossido (O2-) sembra essere prodotto dalla tossina dopo 1 h, mentre né ossido nitrico né formazione di perossinitrito sono stati rilevati. Quindi, il meccanismo di produzione di O2- è stato studiato. Analisi real time-PCR ed analisi western blot suggeriscono un possibile coinvolgimento della NADPH ossidasi (NOX) e della forma inducibile dell’ossido nitrico sintetasi (iNOS) poiché un aumento precoce della loro espressione genica e stata osservata dopo brevi (1 - 4 h) ma non lunghi (24 h) tempi di esposizione. Al contrario, altri enzimi coinvolti nella produzione di ROS (COX-1, COX-2, XOD) sembrano non essere coinvolti nel meccanismo di produzione di O2- da parte della tossina. Inoltre, tramite l'utilizzo di inibitori selettivi di questi enzimi, è emerso che solo il DPI, un inibitore non specifico sia di NOX che di NOS, è in grado di inibire del 15%, 26% e 43% la produzione di O2- indotta da 10-10, 10-9 e 10-8 M PLTX, rispettivamente. Tuttavia, l’NMMA, inibitore delle NOS, riduce in modo significativo solo O2- prodotto da alte (10-8 M), ma non basse (10-9 e 10-10 M) concentrazioni di PLTX, mentre l'inibitore selettivo delle NOX apocinina è totalmente inefficace. Inoltre, poiché la loro co-somministrazione non riproduce l’effetto inibitorio del DPI, un ruolo preminente di questi enzimi nel causare stress ossidativo sembra improbabile. Un'altra fonte possibile di O2- è il mitocondrio. La sua produzione è regolata dal flusso di H+ attraverso le membrane mitocondriali. Infatti, in presenza di nigericina, uno ionoforo che riduce lo squilibrio protonico, i livelli di O2- indotti dalla PLTX vengono significativamente ridotti del 23% (10-9 M PLTX) e 24% (10-8 M PLTX). Inoltre, la co-somministrazione con il rotenone, un inibitore del complesso I della catena mitocondriale di trasporto degli elettroni, che è di per sé inefficace, induce un’ulteriore inibizione di produzione di O2- (-32% e -43% in presenza di 10-9 e 10-8 M PLTX, rispettivamente). Inoltre, la produzione di O2- risulta essere ouabaina-sensibile e Na+-dipendente, ma Ca2+-indipendente. Pertanto, sulla base di questi risultati è stato ipotizzato che il legame della PLTX con la Na+/K+-ATPasi induce un aumento intracellulare di Na+ seguito da aumento intracellulare di H+ con un conseguente aumento di ΔpH attraverso la membrana mitocondriale interna con una sovrapproduzione di O2- indotta dal trasporto inverso degli elettroni attraverso la catena mitocondriale.
In condizioni di stress ossidativo, la disfunzione mitocondriale può essere mediata dall’apertura dei pori di transizione mitocondriali (MPTP). La loro apertura, infatti, viene indotta dalla PLTX già dopo soli 5 minuti di esposizione. Tale apertura, che si è rivelata ciclosporinaA-indipendente, sembra principalmente indotta dallo squilibrio ionico indotto dalla tossina, poiché in terreni privo di Na+ e privo di Ca2+ e in terreno contenente nigericina, l’attività della tossina è fortemente inibita. La rapidissima apertura di MPTP suggerisce che questo è il peculiare meccanismo di citotossicità della tossina e il primum movens della cellule morte. La morte cellulare sembra verificarsi con un danno necrotico. La PLTX, infatti, induce un uptake di PI (marker di necrosi) in maniera concentrazione e tempo-dipendente. Tale uptake è inoltre irreversibile, dopo solo 1 h di esposizione e immagini ottenute al microscopio confocale rivelano drammatiche alterazioni morfologiche, quali rotture della membrana plasmatica e la perdita di contenuto citoplasmatico dopo 4 h. Al contrario, le caspasi 3/7, 8 e 9 non sono attivate dalla PLTX fino a 24 h, né sotto condizioni di recovery. Inoltre, la formazione di corpi apoptotici non è stata rilevata, scartando l’ipotesi di una morte di tipo apoptotico.
Infine, gli effetti della PLTX su alcuni mediatori proinfiammatori quali citochine (IL-1α, IL-6, IL-8 e TNF-α) e metaboliti dell’acido arachidonico (PGE2 e LTB4) sono stati valutati. La tossina (10-11 M) induce una rapida produzione di PGE2 che è tempo-dipendente dopo 2 ore di esposizione. Al contrario, la tossina induce un rilascio ritardato di IL-6 e IL-8 (24 h), anche se alterazioni dell'espressione genica si sono osservate dopo breve tempo di contatto con la tossina (1-4 h). mentre non sono stati osservati effetti valutando IL-1α e TNF -α.
In conclusione, questo studio mette in evidenza le proprietà tossiche in vitro della PLTX su cheratinociti umani. L’elevata citotossicità indotta dalla tossina conduce ad una morte cellulare di tipo necrotico mediata dai mitocondri. Infine, i mediatori infiammatori coinvolti nella proprietà irritanti della pelle della tossina sono stati caratterizzati, ponendo delle basi molecolari per spiegare l'utilizzo di farmaci anti-infiammatori non steroidei in associazione con corticosteroidi.
Ciclo di dottorato: XXIV Ciclo
Keywords: PalytoxinHaCaT keratinocytesCytotoxicityOxidative stressInflammationApoptosis/Necrosis
Type: Doctoral
Language: en
Settore scientifico-disciplinare: BIO/15 BIOLOGIA FARMACEUTICA
NBN: urn:nbn:it:units-9206
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