Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/8568
Title: Nanostrutture di carbonio come vettori per farmaci antitumorali
Other Titles: Carbon nanostructures as carriers for antitumoral drugs
Nanostrutture di carbonio come vettori per farmaci antitumorali
Authors: Lucafo', Marianna
Keywords: FullereneNanomedicineDrug deliveryGene expressionTumor cells
Issue Date: 9-Apr-2013
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Carbon nanotechnology has evolved into a truly interdisciplinary field, bridging material science with medicine. Fullerenes (C60) play a major role in this field and are currently explored for biomedical applications such as radiopharmaceuticals and contrast agents, gene delivery and as carriers for chemotherapeutics. Five fullerene derivatives (F1, F2, F3, F4 and F5), functionalized by 1,3-dipolar cycloaddition of azomethine ylides to the C60 cage, were studied in vitro for their toxicity in a number of cell types and with different assays. Cell cytotoxicity on human mammary carcinoma cell line (MCF7), evaluated with the MTT and NRU tests and further confirmed by a flow cytometry approach with DiOC6 and PI probes, showed that derivative F2 was free of necrotic or apoptotic effects even after a long lasting cell exposure. F3 (differing from F2 for an additional positive charge obtained by quaternarization of the pyrrolidinic nitrogen by introducing a methyl group) was more toxic compared to the other compounds in all cellular models employed (HCT116, MCF7, MCF7/ADR, HT-29, H460, B16F10 and MDAMB231). Its IC50 is 20 µM after 72 hr of incubation by MTT test, and cell accumulation in the G1 phase and arrest in G0 phase (30%) was also observed. The mechanism of cellular uptake (studied with a fluorescein-bearing derivative of F2, hereafter called derivative F2-FITC), and the intracellular distribution were analyzed on MCF7 cell line. The studies of F2 biological effects have shown that this compound is able to enter the treated cells, probably by passive diffusion, to distribute within the cell cytoplasm, without getting into the nucleoplasm or into organelles such as lysosomes and mitochondria; these processes were evaluated by flow cytometry and confirmed by confocal microscopy. Experiments were performed on a multidrug resistant human mammary carcinoma cell line MCF7/ADR, a sub-line resistant to Doxorubicin because of the overexpression of the P-glycoprotein (P-gp) extrusion pump. The choice of these cells was based on our objective to conjugate the anticancer drug Doxorubicin to the fullerene vector in order to overcome adriamycin resistance. The F2 cellular uptake on MCF7/ADR and its maintenance of a constant concentration into cells seem to be insensitive to the presence of P-gp over-expression. These data suggest the possibility for derivative F2 to be used as carrier for anticancer drugs. The experiments on conjugated F2-DOX were made above all to verify if the activity of the drug linked to the fullerene remained the same as the free drug. Furthermore we studied the cellular uptake of F2-DOX in both MCF7 and MCF/ADR lines. Cytotoxicity tests have shown that F2-DOX has an irrelevant activity compared to free drug because Doxorubicin cannot get into the nucleus to perform its activity as it remains linked to F2. Nevertheless, the internalization of F2-DOX is higher in MCF7/ADR compared to the free drug. Fluorescent microscopy technique suggested that the F2-DOX inactivity might be associated with the stability of the bond between the carrier and the drug, which is not released and so is localized in the cytosol, as we have also observed for F2. Since many studies showed contradictory results and the molecular and cellular mechanisms of the cytotoxicity of this class of nanomaterials are not yet fully understood we performed a whole genome expression analysis, by high throughput RNA sequencing, using Illumina technologies. All together, the RNA-seq expression data confirmed the experimental evidence collected with previous in vitro studies showing that F3 is definitely the derivative causing more alterations on MCF7 cells on both the molecular and the cellular levels. However, also F2 is capable of affecting the same molecular pathways, although to a much lower intensity, since neither cytotoxic effects nor cell cycle arrest could be documented. The most important, and somewhat unexpected, result of our analysis was certainly the lack of molecular evidence concerning the activation of the main cellular pathways leading to cell death and often linked to fullerene toxicity in literature. In fact apoptosis, autophagy and ROS damage does not seem to be included among the most relevant molecular effects of F3, which on the contrary are mainly linked to the arrest of the transcription and protein synthesis machineries, leading to the entry in the G0 cell cycle phase. The RNA-seq analysis was able to identify several additional effects of fullerenes which had not been previously described, offering a complete overview of the gene expression alterations induced by these compounds on a whole-transcriptome level. Therefore the combination of large scale molecular analysis and the main viability assays might represent a valuable tool for a better understanding of the toxicity of fullerenes and other nanomaterials.
L’impiego di nanostrutture di carbonio, come i fullereni, in campo biomedico è di forte interesse, sia per le sue possibili applicazioni terapeutiche che diagnostiche. Un potenziale vantaggio di questi composti è la possibilità di essere strutturati per essere facilmente internalizzati dalle cellule e grazie alla loro ampia area superficiale e volume interno possono agire come sistemi di drug delivery per il trasporto di farmaci. Cinque fullereni funzionalizzati (F1, F2, F3, F4 e F5) sono stati studiati in vitro per la loro tossicità in un certo numero di linee cellulari e con dosaggi e tempi di incubazione diversi con l’obiettivo di valutare se gli effetti tossici o meno di questi composti possano variare a seconda dalla linea cellulare utilizzata. I modelli di studio utilizzati sono linee cellulari neoplastiche di carcinoma mammario umano (MCF7, MCF7/ADR e MDAMB231), di adenocarcinoma umano di colon (HT-29 e HCT116), di adenocarcinoma polmonare umano non a piccole cellule (H460) e di melanoma murino (B16F10). Gli studi di citotossicità hanno permesso di individuare un fullerene che presenta una limitata tossicità (F2) con il quale sono state eseguite prove citofluorimetriche sulla linea MCF7 che hanno dimostrato come sia in grado di attraversare le membrane plasmatiche e di accumularsi nelle cellule già dopo un’ora, aumentando in quantità fino a 12 ore. L’analisi è stata condotta fino alle 72 ore, tempo in cui il valore di fluorescenza del fullerene sembra rimanere stabile. Mediante microscopia a fluorescenza, sono stati condotti studi di distribuzione sub-cellulare, dai quali è emerso che F2 non colocalizza né a livello mitocondriale nè lisosomiale; quest’ultima evidenza lo renderebbe un vettore stabile per farmaci acido-labili. Inoltre, la mancata internalizzazione del fullerene a livello nucleare escluderebbe la possibilità di un danno diretto a carico del materiale genetico. In parallelo sono stati condotti i primi esperimenti sul coniugato F2-DOX ma le prove di citotossicità hanno indicato che il coniugato, nella linea MCF7 ed MCF7/ADR, ha attività irrilevante rispetto alla Doxorubicina libera. Tuttavia risulta che la Doxorubicina trasportata da F2 viene internalizzata maggiormente nella linea MCF7/ADR rispetto alla linea MCF7, contrariamente a quanto avviene con il farmaco libero. È possibile quindi affermare che F2 si potrebbe dimostrare un valido vettore per eludere il problema della multidrug resistence nei confronti di farmaci antitumorali causata dall’attività estrusiva della pompa P-gp. L’ostacolo da superare rimane quindi la scelta del farmaco da coniugare visto che questo ipotetico vettore non entra nel nucleo (e che quindi la Doxorubicina e altri antitumorali ad azione nucleare non potrebbero svolgere le proprie funzioni) nelle linee studiate. In alternativa si potrebbe pensare di legare il farmaco al fullerene attraverso un legame più debole in modo da facilitarne il rilascio citosolico. Dal momento che molti studi di tossicità hanno mostrato risultati contraddittori ed i meccanismi molecolari di questa classe di nanomateriali non sono ancora pienamente compresi abbiamo effettuato un’analisi dell’intero trascrittoma sfruttando la tecnologia Illumina. I dati ottenuti mediante l’utilizzo di questa tecnica di next generation sequencing (RNA-Seq) hanno confermato l'evidenza sperimentale raccolta con i precedenti studi in vitro dimostrando che F3 è sicuramente il derivato che causa più alterazioni sulle MCF7, sia a livello molecolare che cellulare. Tuttavia è stato osservato che F2 è in grado di pregiudicare le stesse vie molecolari, anche se con un'intensità molto più bassa. Il risultato più importante, e inaspettato, emerso dalle nostre analisi è stato certamente la mancanza di prove molecolari riguardanti l'attivazione delle vie principali che portano alla morte cellulare e spesso legati alla tossicità fullerene, come descritto in letteratura. Apoptosi, autofagia o stress da produzione di ROS non sembrano essere inclusi tra gli effetti molecolari più rilevanti di F3, che al contrario sono principalmente legati all'arresto della trascrizione e alla sintesi proteica, fenomeni che conducono all’arresto della divisione e all'entrata in fase G0. L'analisi di RNA-seq è stata in grado di identificare diversi effetti addizionali dei fullereni che non erano state precedentemente descritti, offrendo una panoramica completa delle alterazioni di espressione genica indotte da questi composti sull’intero trascrittoma. Quindi la combinazione di analisi molecolari su larga scala e saggi di vitalità potrebbe rappresentare un valido strumento per una migliore comprensione della tossicità dei fullereni ed altri nanomateriali.
Description: 2011/2012
URI: http://hdl.handle.net/10077/8568
NBN: urn:nbn:it:units-9973
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