Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/8575
Title: Nanotechnology Applications in Quantitative Neuroscience: Proteomic Analysis of Malignant Gliomas
Authors: Ganau, Mario
Supervisore/Tutore: Casalis, Loredana
Scoles, Giacinto
Issue Date: 9-Apr-2013
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Abstract (English) The current limit of knowledge advancement in proteomic analysis of gliomas, the most common primary malignant brain tumors, is related to the high sensitivity required to detect specific biomarkers within few cells volumes. To address this problem we developed a quantitative approach to eventually enable precise, high throughput and low cost analysis of glial cells with potential capability of real-time pathological screening and subtyping of brain tumors. A device consisting in micro-fabricated wells capable to isolate and host living astrocytes was designed and functionalized. Then for the fabrication of a nanobiosensor, able to detect in small volumes the presence of specific biomarkers, ideally for multiplexing assays and meant to fit within the small dimensions of this microdevice, an approach consisting in DNA-directed-immobilization (DDI) of biotinylated antibodies (Abs) on a single stranded DNA (ssDNA) nanoarray, produced by Atomic Force Microscopy (AFM) nanografting, was carefully optimized. The proof of concept was realized with Abs specific for Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), a biomarker which belongs to the family of intermediate filaments and is crucial in cell’s differentiation, within a platform ready for parallelization. Nanosized patches of thiol modified ssDNA were prepared by AFM-based nanografting inside a matrix of self assembled monolayers (SAM) of alkanethiol-modified gold surfaces. Subsequently a complementary DNA strand (cDNA) conjugated to streptavidin (STV) was allowed to covalently bind to the patch by sequence specific DNA hybridization. Finally the biotin binding sites of STV were exploited to immobilize biotinylated monoclonal GFAP Abs (already in use for ELISA assays) on the top of those nanopatches. The efficiency of those nano-immuno arrays was tested by successfully obtaining the immobilization of purified recombinant GFAP protein, down to a concentration of 4 nM, firstly in standard PBS then in multicells’ lysate obtained from U87 glial cultures. The immobilization was detected by means of AFM measuring step by step the increases in the height of the patches and excluding modification of the roughness of both the SAM and the nanopatches after incubation with the cells’ lysate through a signal to noise ratio analysis. Titration curves for a comparison of sensitivity between this technique and the conventional ELISA assays are provided, they indeed confirm that the sensitivity of our nanosensors is at least that of ELISA, with the advantage of the scalability of the device.
Abstract (Italiano) L’attuale limite di avanzamento dello stato dell’arte dell’analisi proteomica dei gliomi cerebrali, la classe istologica di tumori cerebrali più frequente ed aggressiva, è legato alla difficoltà di individuare specifici biomarkers in piccoli volumi cellulari. Per superare questo limite si è deciso di sviluppare un approccio nanoquantitativo che consenta un’analisi proteomica precisa, ad alta sensibilità e basso costo, degli astrociti tumorali, con potenzialità di screening in tempo reale e sottotipizzazione di tumori cerebrali. Previa fabbricazione e funzionalizzazione di micro pozzetti idonei ad ospitare cellule astrocitarie, ci si è dedicati alla realizzazione di biosensori in grado di riconoscere specifici biomarkers e di essere accoppiati ai micro pozzetti. Al fine di immobilizzare anticorpi specifici per proteine di interesse in ambito neuroncologico, è stato scelto un approccio basato sul nanografting con Microscopio a Forza Atomica (AFM) e sull’immobilizzazione diretta sul DNA di anticorpi (DDI). In particolare la prova concettuale è stata condotta con anticorpi specifici per la Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), un marcatore della differenziazione astrocitaria appartenente alla famiglia dei filamenti intermedi intracellulari, su una piattaforma atta ad una successiva parallelizzazione. I nanocostrutti responsabili del riconoscimento della proteina d’interesse, sono stati realizzati partendo da molecole di DNA a singola elica (ssDNA) graftate in una matrice di monostrati autoassemblati (SAM) di superfici d’oro alchiltiolo modificato. Al fine di sfruttare la capacità della streptavidina (STV) di legarsi ad anticorpi biotinilati è stata successivamente indotta l’ibridazione di un filamento di DNA complementare (cDNA) a quello precedentemente immobilizzato sulla superficie nanoassemblata che presentasse anche una coda di STV. I siti di legame per la biotina intrinseci al tetramero di STV sono quindi stati sfruttati per immobilizzare sulla superficie dei nanocostrutti degli anticorpi monoclonali biotinilati specifici per GFAP (già in uso per i protocolli ELISA). L’efficienza dei nano-immuno costrutti così ottenuti è stata testata ottenendo l’immobilizzazione di GFAP ricombinante anche a basse concentrazioni (fino a 4nM), sia in presenza di standard PBS, sia in presenza di un lisato multicellulare ottenuto da colture gliali di cellule U87. L’immobilizzazione di GFAP è stata confermata dall’incremento in altezza dei nanocostrutti misurato all’AFM escludendo modificazioni del rapporto segnale/rumore sia del SAM che dei nanocostrutti prima e dopo aggiunta di lisato multicellulare. Il limite di sensibilità del prototipo così ottenuto è stato confrontato con quello raggiungibile con protocolli standard ELISA, mostrando una sensibilità almeno comparabile all’ELISA a fronte di un maggiore potenziale diagnostico legato alla sua scalabilità.
Ciclo di dottorato: XXV Ciclo
metadata.dc.subject.classification: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NANOTECNOLOGIE
Description: 2011/2012
Keywords: Gliomas
Proteomics
Nanosensors
Atomic Force Microscopy
Quantitative Neuroscience
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: FIS/03 FISICA DELLA MATERIA
NBN: urn:nbn:it:units-9980
Appears in Collections:Scienze fisiche

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