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Title: Identification of vesicular SNARE proteins involved in the secretoryintracellular trafficking of IL-12 in dendritic cells
Other Titles: Identificazione di proteine SNARE vescicolari coinvolte nel traffico intracellulare secretorio dell'IL-12 nelle cellule dendritiche
Authors: Chiaruttini, Giulia
Supervisore/Tutore: Benvenuti, Federica
Issue Date: 22-Apr-2013
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells. They have the unique ability of recognizing antigens, internalizing and processing them for presentation on MHC complexes. DCs also express pattern-recognition receptors like Toll-like receptors (TLRs), which recognize pathogen-associated molecular patterns and induce DCs maturation. As a consequence DCs increase their antigens presenting ability, their levels of co-stimulatory molecules on the cell surface, and their production of cytokines, which are critical for inducing specific T cell activation. All these functions make DCs key elements in the immunological response against pathogens, viruses and tumors. One of the most important cytokines in T cell priming, interleukine-12 (IL-12), begins to be largely transcribed immediately after TLR activation. We have previously shown that in DCs engaged in antigen specific immunological synapses (IS), IL-12 is found enriched in the proximity of the contact site between DC and T cells, and several evidences suggest that its secretion is polarized towards the T cell. These data indicate that polarized trafficking of cytokines containing vesicles in DCs is a mechanism to optimize T cell priming. Polarized trafficking of soluble mediators through defined subcellular areas has been described as fundamental for the function of several other immune cells, but at present a clear characterization of the pathways and organelles implicated in the regulation of cytokine secretion in dendritic cells is still missing. The family of SNARE (soluble-N ethylmaleimide sensitive-factor accessory-protein (SNAP) receptor) proteins, which regulate the membrane fusion process during the intracellular trafficking of soluble mediators, has emerged as the most informative for the identification of such pathways. Indeed different SNAREs regulate diverse mechanisms such as the constitutive secretion of immune mediators, phagocytosis and endocytosis, or also the release of inflammatory mediators and products from secretory granules. During my thesis I have investigated the role of SNAREs in IL-12 secretion by DCs. I have analyzed the expression and modulation during maturation of three SNAREs, Syntaxin6, VAMP3 and VAMP7, that were previously shown to play a role in other immune cells. The subcellular localization and co-localization with the IL-12 subunits were analyzed in DCs alone and in the context of IS by immunofluorescence. I performed functional analyses by silencing SNAREs with the siRNA strategy to detect impairment in DC cytokines secretion and in T cell priming. These studies led to the identification of the lysosomal-late endosomal VAMP7 as a specific regulator in the polarized secretion of IL-12 during T cell priming. This suggest a role, in the secretion of soluble newly synthesized mediators, of late endosomal organelles, until now thought to be implicated only in the regulated secretion of pre-constituted mediators such as cytotoxic granules. Furthermore VAMP3 was found to downregulate the production of all the cytokines tested; we propose this SNARE as regulator of the TLR9 signaling pathway. The second part of the work stems from the concept that DCs properties become suppressed by the tumor microenvironment and many evidences suggest that tolerogenic DCs may be a crucial element in the development of tumor-mediated immune anergy. Different steps in the antigen presentation process are impaired, but also the pattern of secreted cytokines is skewed. In particular, how secretion of inflammatory cytokines becomes impaired in tumor-exposed DCs has not been investigated. I set up a model of mice bearing Lewis lung carcinoma (3LL) to analyze DCs in vitro (co-colture) and in vivo (spleen and tumor-bearing lungs). In all the models I observed a strong impairment in IL-12 production, upon restimulation with TLR agonists. In spleen DCs subtypes remained unchanged during tumor progression, whereas in tumor-bearing lungs the DC composition varied, with an expansion of CD11bhi DCs and a reduction in CD103+ DCs. DCs were isolated from all the three models to analyze the expression of trafficking proteins, and I found that tumor-exposed DCs downregulate all the SNAREs and in particular VAMP3. Moreover Rab27a, a GTPase implicated in the regulation of the exocytosis of secretory granules and lysosome-related organelles is also downregulated at protein level. These preliminary observations suggest that regulation of trafficking proteins in DCs may represent a novel pathway targeted during immunosuppression.
Le cellule dendritiche (DC) sono una importante classe di cellule presentanti l'antigene. Hanno l'esclusiva abilità di riconoscere gli antigeni, internalizzarli e processarli per la loro presentazione con il complesso maggiore di istocompatibilità. Le DC esprimono anche recettori "riconoscitori di pattern" come i recettori Toll-like (TLR), che riconoscono pattern molecolari associati ai patogeni e inducono la maturazione delle DC. Come conseguenza le DC aumentano la loro capacità di presentare gli antigeni, i loro livelli di molecole costimolatorie sulla superficie cellulare, e la loro produzione di citochine, che sono fondamentali per indurre l'attivazione specifica delle cellule T. Tutte queste funzioni rendono le DC elementi chiave nella risposta immunologica contro i patogeni, i virus e i tumori. Una delle più importanti citochine per l'induzione delle cellule T, l'interleuchina 12 (IL-12), inizia ad essere estensivamente trascritta immediatamente dopo l'attivatione dei TLR. Il nostro gruppo ha precedentemente mostrato che nelle DC impegnate in sinapsi immunologiche-antigene specifiche (IS), l'IL-12 si trova arricchita in prossimità del sito di contatto tra la DC e le cellule T, e varie evidenze suggeriscono che la sua secrezione è polarizzata verso la cellula T. Questi dati indicano che il traffico polarizzato di vescicole contenenti citochine nelle DC è un meccanismo per ottimizzare l'induzione delle cellule T. Il traffico polarizzato di mediatori solubili attraverso definite aree intracellulari è stato descritto come fondamentale per la funzione di varie cellule immunitarie, ma attualmente una chiara caratterizzazione delle vie di secrezione delle citochine nelle cellule dendritiche è ancora mancante. La famiglia delle proteine SNARE (soluble-N ethylmaleimide sensitive-factor accessory-protein (SNAP) receptor), che regolano il processo di fusione tra le membrane durante il traffico intracellulare di mediatori solubili, è emersa come la più informativa nell'identificazione di questo tipo di vie. Infatti diverse SNARE regolano diversi meccanismi, come la secrezione costitutiva di mediatori immunologici, la fagocitosi e l'endocitosi, o anche il rilascio di mediatori infiammatori e di prodotti sui granoli secretori. Durante la mia tesi ho investigato il ruolo delle SNARE nella secrezione dell'IL-12 nelle DC. Ho analizzato l'espressione e la modulazione durante la maturazione delle SNARE syntaxin6, VAMP3 e VAMP7, precedentemente descritte in altre cellule immunitarie. La localizzazione subcellulare e la colocalizzazione con le subunità dell'IL-12 sono state analizzate nelle DC da sole e nel contesto dell'IS attraverso l'immunofluorescenza. Ho svolto studi funzionali silenziando le SNARE con la strategia dei siRNA, per osservare diminuzioni nella secrezione delle citochine nelle DC. Questi studi hanno portato all'identificazione della lisosomale VAMP7 come regolatore specifico nella secrezione polarizzata dell'IL-12 durante l'induzione delle cellule T. Questo suggerisce un ruolo nella secrezione di mediatori solubili neosintetizzati, degli organelli endosomiali tardivi , finora ritenuti implicati solo nella secrezione regolata di mediatori pre-costituiti come i granuli citotossici. Inoltre si è visto che VAMP3 deregola la produzione di tutte le cotochine testate; proponiamo che questa SNARE sia un regolatore della via di segnalazione del TLR9. La seconda parte del lavoro parte dal concetto che le proprietà delle DC sono soppresse dal microambiente tumorale e molte evidenze suggeriscono che le DC tollerogeniche sarebbero un elemento fondamentale nello sviluppo dello spegnimento immunologico mediato dal tumore. Diversi punti nel processo di presentazione dell'antigene sono deregolate, ma anche il pattern di citochine secrete è modificato. In particolare, come la secrezione di citochine infiammatorie diventi deregolata nelle DC esposte al tumore non è stato investigato. Ho messo a punto un modello di topi con carcinoma polmonare di Lewis (3LL) per analizzare le DC in vitro (con co-colture) e in vivo (nella milza e nel polmone). In tutti i modelli ho osservato una forte diminuzione nella produzione dell'IL-12, dopo stimolazione con agonisti del TLR. Nella milza i sottotipi di DC sono rimasti simili durante la progressione tumorale, mentre nei polmoni affetti da tumore la composizione delle DC è variata, con un'espansione delle DC CD11b e una riduzione delle DC CD103. Le DC sono state isolate da tutti e tre i modelli per analizzare l'espressione delle proteine di traffico e ho osservato che le DC esposte al tumore deregolano tutte le SNARE e in particolare VAMP3. Inoltre anche Rab27a, una GTPasi implicata nella regolazione dell'esocitosi dei granuli secretori e degli organelli lisosomiali è trovata de-regolata a livello della proteina. Queste osservazioni preliminari suggeriscono che la regolazione delle proteine di traffico nelle DC potrebbe rappresentare una nuova via bersagliata durante lo sviluppo tumorale.
Ciclo di dottorato: XXV Ciclo
metadata.dc.subject.classification: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
Description: 2011/2012
Keywords: Dendritic cells
SNARE
IL-12
Intracellular trafficking
Immunological synapse
Regulatory DC
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: BIO/11 BIOLOGIA MOLECOLARE
NBN: urn:nbn:it:units-10062
Appears in Collections:Scienze biologiche

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