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Title: Internal targets and killing mechanism of the cathelicidin Bac7 in Gram-negative bacteria
Other Titles: Internal targets and killing mechanism of the cathelicidin Bac7 in Gram-negative bacteria
Bersagli interni e meccanismo di uccisione della catelicidina Bac7 in batteri Gram-negativi.
Authors: Mardirossian, Mario
Supervisore/Tutore: Gennaro, Renato
Scocchi, Marco
Issue Date: 22-Apr-2013
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: 
Bac7(1-35) is the smallest fragment of the proline-rich cathelicidin Bac7 that shows the same
antibacterial activity as the whole natural peptide of 60 residues. In this work, we remarked that the
unique gene whose deletion can confer resistance to E. coli against Bac7(1-35) is sbmA, coding for
an inner membrane protein involved in the penetration of this peptide into bacterial cells. Moreover,
we provided evidence that SbmA is also involved in the transmembrane transport of a fragment of
another proline-rich antimicrobial peptide, arasin1(1-23), isolated from the spider crab. These
findings suggest a general role of this membrane protein in the uptake of proline-rich antimicrobial
peptides (PR-AMPs) into Gram-negative bacteria.
We then measured the intrabacterial concentration reached by Bac7(1-35) in E. coli, and observed
that this increases from micromolar in the medium to millimolar within the bacterial cell,
suggesting that it may bind to cytosolic structures. For this reason, we looked for possible
interactions between Bac7(1-35) and macromolecules involved in viable processes of bacteria.
These studies showed that Bac7(1-35) completely inhibits in vitro the transcription/translation
process starting from a concentration of 50 μM. Then we demonstrated that inhibition is: i) specific
for Bac7(1-35), since it is not exerted by other cathelicidin-derived AMPs not belonging to the Prorich
group, and ii) not stereo-specific, since it is exerted at the same level by the all-D isomer of
Bac7(1-35).
We also demonstrated the ability of Bac7(1-35) to bind DNA in vitro, but we excluded that this
binding may represent the primary mechanism of bactericidal action. We also showed that the
peptide does not significantly affect in vitro the transcription process, deducing that the inhibition of
the transcription/translation targets primarily the translation process.
We verified these data in vivo on E. coli cells measuring the incorporation of radioactive precursors
of bacterial macromolecules. We observed that the exposure of bacteria to Bac7(1-35) inhibited the
incorporation of radioactive leucine, but not of radioactive thymidine and uridine, indicating a
specific block at the protein synthesis level and not of DNA and RNA synthesis.
In the near future, a clearer definition of the intrabacterial target(s) of Bac7(1-35) would hopefully
lead to the experimentation of this molecule or of its derivatives as a new generation antibiotic drug.

Bac7(1-35) è il più breve frammento del peptide Bac7, una catelicidina ricca in prolina di 60
residui, dotato della stessa attività battericida del peptide intero. In questo lavoro di tesi, abbiamo
rimarcato che sbmA è l’unico gene la cui delezione conferisce ad E. coli una resistenza a Bac7(1-
35). Tale gene codifica per una proteina della membrana interna coinvolta nell’ingresso del peptide
nel citoplasma della cellula batterica. Inoltre, abbiamo dimostrato che SbmA è coinvolta anche nel
trasporto transmembrana di un frammento di un altro peptide antimicrobico, l’arasina1(1-23). Tali
risultati suggeriscono che questa proteina giochi un ruolo generale nell’internalizzazione di peptidi
antimicrobici ricchi in prolina nei batteri Gram-negativi.
Abbiamo quindi misurato la concentrazione intrabatterica raggiunta da Bac7(1-35) in E. coli e
abbiamo osservato che questa aumenta da valori micromolari nel terreno di coltura a millimolari nel
citosol batterico, suggerendo un suo legame a strutture interne della cellula. Per questo abbiamo
cercato possibili interazioni tra il peptide e macromolecole coinvolte in processi vitali del batterio.
Con questi studi abbiamo appurato che Bac7(1-35) in vitro inibisce completamente il processo di
trascrizione/traduzione a partire da una concentrazione di 50 μM. Successivamente abbiamo
dimostrato che questa inibizione è una peculiarità di Bac7(1-35), in quanto altri AMP derivati da
catelicidine ma non ricchi in prolina non hanno dimostrato un’attività comparabile. Inoltre, questa
inibizione non è stereo-specifica, in quanto anche l’isomero D di Bac7(1-35) blocca tale processo
esattamente come il suo isomero L.
Abbiamo inoltre dimostrato la capacità di Bac7(1-35) di legare in vitro il DNA, ma abbiamo escluso
che tale legame rappresenti il meccanismo primario della sua attività battericida. Abbiamo anche
dimostrato che il peptide non interferisce in vitro in maniera significativa con il processo di
trascrizione, deducendo che l’effetto osservato sul processo di trascrizione/traduzione fosse da
attribuirsi prevalentemente all’inibizione della traduzione.
Abbiamo verificato tali dati in vivo su cellule di E. coli misurando l’incorporazione di precursori
radioattivi delle macromolecole batteriche. Abbiamo osservato che l’esposizione di batteri a
Bac7(1-35) bloccava l’incorporazione di leucina radioattiva ma non di timidina ed uridina,
indicando un blocco specifico della sintesi proteica ma non di quelle di DNA e RNA.
In futuro, una definizione ancora più chiara del target intrabatterico di Bac7(1-35) potrebbe portare
alla sperimentazione di tale molecola o di suoi analoghi come farmaci antibiotici di nuova
generazione.
Ciclo di dottorato: XXV Ciclo
metadata.dc.subject.classification: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
Description: 
2011/2012
Keywords: Antimicrobial peptide
proline-rich
Bac7
intrabacterial target
transcription/translation
cathelicidin
intrabacterial concentration
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: BIO/10 BIOCHIMICA
NBN: urn:nbn:it:units-10066
Appears in Collections:Scienze biologiche

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