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Title: Identification and characterization of CDH1 germline variants in sporadic gastric cancer patients and in individuals at risk of gastric cancer
Other Titles: Identificazione e caratterizzazione di varianti germinali del gene CDH1 nel carcinoma gastrico sporadico e in individui a rischio di carcinoma gastrico
Authors: Garziera, Marica
Keywords: CDH1 germline mutationGastric CancerE-cadherinFirst Degree RelativesAutoimmune Metaplastic Atrophic Gastritis3D structural modelling
Issue Date: 23-Apr-2013
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Abstract Gastric cancer (GC) remains a leading cause of cancer death worldwide. A hallmark of this type of tumour is the poor prognosis of patients. Identification of subjects with an increased risk of developing GC and the early detection of GC, are promising approaches to reduce the morbidity and mortality of this malignancy. CDH1 gene encodes E-cadherin, a known tumour suppressor protein expressed in epithelial cells that plays a major role in cellular adhesion and tissue architecture maintenance. CDH1 gene mutations are thought to affect protein function and lead to cell-cell adhesion deregulation in epithelial tissues and to enhance metastatic tumour potential. Germline mutations in CDH1 gene are implicated in hereditary diffuse gastric cancer (HDGC) syndrome and in early onset gastric cancer (EOGC), but the role of these variants in sporadic GC and in subjects at risk to develop GC, is poorly investigated. Most studies limit the screening of CDH1 mutations to patients with HDGC, familial GC or GC patients at very early onset through genetic counselling, but only few studies investigated the CDH1 the contribution of these mutations in sporadic GC cases without familial aggregation or in subjects at risk of developing GC. Moreover, the potential functional effects of CDH1 variants are not always explored. In our study, screening of the entire coding region and all exon flanking sequences of the CDH1 gene was performed by direct sequencing in a series of random, consecutive sporadic GC cases. We extended the analysis of CDH1 germline mutations in a collection of individuals at risk for GC: 59 subjects who reported an ascertained case of GC among parents, children, siblings or offspring’s, named first degree GC-Relatives (FDR), and 20 autoimmune metaplastic atrophic gastritis (AMAG) patients. In the study 52 healthy blood donors (BD) were also included in the CDH1 analyses. The aim of this PhD project was to evaluate CDH1 mutations in these individuals to identify a possible hereditable marker that might improve the early detection of GC, stratifying high risk subjects in association with other known risk factors for GC diagnosis. All the participants were voluntarily subjected to a gastrointestinal endoscopy with biopsy in our institution. This is the first study in which CDH1 screening was investigated in AMAG patients. CDH1 germline mutations found were characterized by means of structural modelling and bioinformatic tools, immunohistochemical (IHC) stains for evaluation of E-cadherin and β-catenin proteins expression and subcellular localization, and E-cadherin mRNA level by real-time polymerase chain reaction (PCR). The functional impact of splicing was assessed for non-polymorphic intronic variants. Among the 59 GCs, the lower portion (antrum) of the stomach was the prevalent anatomic site (p< 0.05) for the tumours detected by endoscopy. No statistically differences were found comparing associations between gender, histotype, tumour location, H. Pylori infection, and TNM staging. A complex panel of germline variants was detected for CDH1 gene. In GC series, we found six different alterations in nine distinct GC patients (15.2%): 67% of the missense type (p.G274S; p.A298T; p.T470I: p.A592T) and 33% of non-missense type, one in the promoter region (5’UTR-71C>G) and one in the intronic region close to exon 13 (IVS12 c.1937-13T>C). All the missense substitutions are localized in the extracellular functional E-cadherin domain which is directly implied in cell-cell adhesion mechanisms. Of note the germline missense (p.G274S) was a new CDH1 mutation, while the p.A298T was already found only in HDGC syndrome and it was described as pathogenetic. Our molecular modelling studies highlighted that p.G274S change in mature protein is not dramatic for local structure but the serine residue represents a potential site for post translation modifications, such as phosphorylation or glycosylation. However, data from our functional in vitro assays did not support an effect of this mutation on adhesion mobility of cells. Moreover, E-cadherin was not under expressed in the tumour gastric tissue of patient harbouring the p.G274S, even if a reduction in β-catenin expression was observed in the same sample. Therefore, the pathogenic effect of p.G274S change by our in silico and in vitro approaches seems to be unlikely, so we cannot conclude the significance of this mutation. Modelling and SIFT results confirmed that the p.A298T substitution affects protein function, while the p.T470I change is tolerated. Through the structural analysis for p.T470I, we hypothesized a protective role that may favour protein-protein interactions in the extracellular medium. The p.A592T was detected in the four studied groups, suggesting that it is a polymorphic variant (frequence >1%). Modelling suggested a non-pathogenic role as already confirmed by published in vitro and in silico studies. The C-to-G change before the start codon (-71C>G), represented the most common variant associated with GC in our series, occurring in three (5.1%) out of 59 GC patients. Due to a lack of tumour material, an evaluation or a correlation between CDH1 hypermethylation and E-cadherin expression was not performed, so the predicted pathogenicity of this promoter variant still remains to be elucidated. The intronic IVS12 c.1937-13T>C variant was found in two GC patients and in one BD, but it was already described in HDGC and EOGC subjects. Our assays demonstrated for the first time that this substitution leads to an aberrant CDH1 transcript harbouring a deletion of exon 11 with the formation of a premature stop codon in the extracellular E-cadherin domain. The translated protein will lack part of the extracellular domain, and completely loose the transmembrane domain and the cytoplasmic tail of E-cadherin, which is involved in β-catenin binding. Moreover, IHC stains showed a reduction in the expression of E-cadherin and β-catenin in the gastric tumour tissues of patients harbouring this intronic mutation. Evaluation by real time-PCR of E-cadherin expression from the EBV immortalized B-lymphocytes from one GC patient carrying this mutation showed a strong (60%) and significantly reduction (p<0.01) compared with the control without CDH1 alterations, and the BD with the same CDH1 alteration. In FDR high risk group, we found one substitution in the 5’UTR promoter region (-54G>C) already described as a rare variant able to decrease the transcriptional activity of CDH1, one 5’ near gene variant (-176C>T) with unknown significance, and an intronic mutation close to exon 5, IVS4 c.532- 18C>T, already reported in EOGC cases. This last one showed no effects in producing CDH1 aberrant splicing, as the new germline mutation in the intronic region close to exon 1 (IVS1 c.48+7C>T) found in one AMAG patient. Other variants in the AMAGs were polymorphic, and thus we excluded a potential effect of these on E-cadherin function. In conclusion, our results show that pathogenic CDH1 germline variants (p.A298T) can also be detected in sporadic GC patients without fulfilling the strict criteria for HDGC. We also report the finding, in a sporadic GC, of a new missense germline mutation (p.G274S) with an uncertain significance. Furthermore, we demonstrate for the first time a potential deleterious effect on splicing and a decreased E-cadherin expression for the intronic IVS12 c.1937-13T>C mutation. Our detection of the same genetic alteration and splicing effect in one BD, but with a limited effect on E-cadherin mRNA level, is intriguing and deserves further studies. Performing CDH1 screening in individuals at risk for GC, we detected the IVS4 c.532-18C>T variant already reported in EOGC cases, and a new IVS1 intronic mutation in one AMAG patient, although there was no influence on CDH1 splicing in both cases. The overall percentage of the missense mutations (67%) in our series is predominantly of the non-missense type, suggesting that the North-East of Italy should be considered as a middle-to-high-risk area for the incidence of E-cadherin mutations and the risk of GC. Moreover, variants identified in the FDR and AMAG subjects that, until now, have only been described for GC patients, and recent findings of novel mutations in sporadic GC patients, encourage us to continue to screen for CDH1 genetic alterations that, in addition to other risk factors, could be used to define a high-risk group of patients that would benefit from an early GC diagnosis.
Riassunto Il cancro gastrico (GC) rimane una delle maggiori cause di mortalità dovuta al cancro a livello mondiale. Un elemento caratteristico di questo tipo di tumore è la scarsa prognosi dei pazienti. L’identificazione dei soggetti maggiormente a rischio per lo sviluppo di GC e la diagnosi precoce per questo tipo di tumore, sono approcci promettenti per ridurre la morbidità e la mortalità di tale patologia. Il gene CDH1 codifica per E-caderina, una nota proteina oncosoppressore espressa nelle cellule epiteliali che gioca un ruolo prominente nell’adesione cellulare e nel mantenimento dell’architettura tissutale. Si ritiene che mutazioni germinali a carico del gene CDH1 siano in grado di influenzare la funzione della proteina e compromettere l’adesività cellulare nei tessuti epiteliali, aumentando il potenziale metastatico del tumore. Mutazioni germinali a carico del gene CDH1 sono implicate nella sindrome del carcinoma gastrico di tipo diffuso ereditario (HDGC) e nel carcinoma gastrico ad insorgenza precoce (EOGC), ma il ruolo di tali varianti nel GC di tipo sporadico e nei soggetti a rischio di sviluppare GC sono scarsamente indagate. La maggior parte degli studi limita lo screening di mutazioni del gene CDH1 nei pazienti con HDGC, forme familiari di GC o pazienti con GC in forma precoce attraverso consulenza genetica, ma solamente un numero limitato di studi ha valutato il contributo di queste mutazioni nel gene CDH1 nella casistica sporadica di GC priva di familiarità o in soggetti ad elevato rischio di sviluppare questo tumore. Inoltre, i potenziali effetti funzionali delle varianti nel gene CDH1 spesso non sono approfonditi. Nel nostro studio, lo screening dell’intera regione codificante e delle sequenze fiancheggianti gli esoni del gene CDH1 è stato condotto attraverso sequenziamento diretto in una serie casuale e consecutiva di pazienti con GC sporadico. Abbiamo esteso l’analisi per la ricerca di mutazioni germinali di CDH1 in un gruppo di individui a rischio per GC: 59 soggetti che hanno riportato un caso accertato di GC tra genitori, figli, fratelli o cugini, denominati parenti di primo grado-GC (FDR), e 20 pazienti affetti da gastrite atrofica metaplasica autoimmunitaria (AMAG). Nello studio sono stati inclusi anche 52 donatori di sangue sani (BD). Lo scopo di questo progetto di dottorato era valutare le mutazioni a carico del gene CDH1 in tali individui per identificare un possibile marker ereditario che possa migliorare la diagnosi precoce del GC, con la prospettiva di andare a stratificare i pazienti ad alto rischio in associazione con altri marcatori di rischio già noti. Tutti i partecipanti sono stati volontariamente sottoposti ad una endoscopia gastrointestinale con biopsia nel nostro istituto. Questo è il primo studio nel quale lo screening per il gene CDH1 è stato valutato nei pazienti con AMAG. Le mutazioni germinali trovate nel CDH1 sono state caratterizzate attraverso l’uso del modelling strutturale e di strumenti bioinformatici, colorazioni immunoistochimiche (IHC) per valutare sia l’espressione che la localizzazione cellulare delle proteine E-caderina e β-catenina, e il livello di mRNA per E-caderina con la tecnica di real-time PCR. L’impatto funzionale nello splicing è stato determinato per le varianti introniche non polimorfiche. Tra i 59 GC, la porzione inferiore (l’antro) dello stomaco era la sede anatomica prevalente (p< 0.05) dei tumori rilevati mediante endoscopia. Non sono state trovate differenze statistiche confrontando associazioni tra sesso, istotipo e localizzazione del tumore, infezione da Helicobacter Pylori e stadi TNM. Un complesso pannello di varianti germinali è stato riscontrato per CDH1 nella nostra casistica. Nella serie di pazienti con GC, abbiamo trovato sei differenti alterazioni genetiche in nove distinti pazienti (15.2%): 67% del tipo missenso (p.G274S; p.A298T; p.T470I: p.A592T) e 33% non missenso, una nella regione del promotore (5’UTR-71C>G) e una nella regione intronica in prossimità dell’esone 13 (IVS12 c.1937-13T>C). Tutte le sostituzioni missenso sono localizzate nel dominio extracellulare di E-caderina che è direttamente coinvolto nel processo di adesività cellulare. Rilevante è stata l’identificazione di una nuova mutazione germinale missenso di CDH1 (p.G274S), mentre la mutazione p.A298T era stata precedentemente documentata solo nella sindrome HDGC e descritta come patogenetica. I nostri studi di modelling strutturale hanno evidenziato che la sostituzione p.G274S nella proteina matura non sembra avere un impatto notevole nel perturbare la struttura locale, ma il residuo di serina rappresenta un potenziale sito per modificazioni post traduzionali, come la fosforilazione o la glicosilazione. Comunque, dati ottenuti dai nostri esperimenti funzionali condotti in vitro sembrano non supportare alcun tipo di effetto da parte di tale mutazione sulla mobilità e adesività cellulare. Inoltre, E-caderina non era ipoespressa nel tessuto tumorale gastrico del paziente con la variante p.G274S, dove però è stata osservata una riduzione nell’espressione di β-catenina. Quindi, grazie alla valutazione sia in silico che in vitro, il ruolo patogenetico della mutazione p.G274S sembra essere improbabile, e il reale significato di questa alterazione risulta comunque incerto. Il modelling e i risultati ottenuti con lo strumento bioinformatico SIFT confermano che la sostituzione p.A298T è in grado di interferire sulla funzionalità della proteina, che invece non è influenzata dalla mutazione p.T470I la quale sembra essere tollerata. Attraverso l’analisi strutturale abbiamo ipotizzato un ruolo protettivo per la variante p.T470I che sembra favorire le interazioni proteina-proteina nel contesto dello spazio extracellulare. La sostituzione p.A592T è stata riscontrata in tutti i quattro gruppi di soggetti studiati, suggerendo che si tratta di una variante polimorfica (frequenza >1%). L’approccio condotto con il modelling suggerisce un ruolo non patogenetico come già confermato e descritto da studi pubblicati condotti sia in vitro che in silico. La sostituzione da C a G prima del codone di inizio (-71C>G), rappresenta la variante più comune rilevata nella nostra casistica, in quanto trovata in tre (5.1%) dei 59 pazienti con carcinoma gastrico. Purtroppo, a causa della mancanza di campione biologico tumorale non è stato possibile valutare una correlazione tra un eventuale stato di ipermetilazione a carico del promotore di CDH1 e l’espressione della E-caderina, perciò l’effettivo contributo di tale variante sulla trascrizione del gene rimane ancora da definire. La variante intronica IVS12 c.1937-13T>C è stata trovata in due pazienti con GC e in un BD, ma era già stata precedentemente descritta nella sindrome ereditaria HDGC e in soggetti affetti da EOGC. I nostri esperimenti hanno dimostrato per la prima volta che questa mutazione produce un trascritto aberrante di CDH1 con delezione dell’esone 11 e la formazione di un codone di stop prematuro a livello del dominio extracellulare di E-caderina. La proteina tradotta risulterà priva di gran parte del dominio extracellulare, e perderà completamente il dominio trans membrana e la coda citoplasmatica che è direttamente coinvolta nel legame con la β-catenina. Inoltre, la valutazione mediante IHC ha evidenziato una riduzione nell’espressione di E-caderina e β-catenina nei tessuti tumorali gastrici dei due pazienti che presentavano tale variante intronica. La valutazione mediante real time-PCR dell’espressione di E-caderina nei linfociti B immortalizzati con il virus EBV, in uno dei due pazienti GC con tale mutazione, ha mostrato una forte (60%) e significativa (p<0.01) riduzione rispetto sia al donatore sano senza alterazioni germinali di CDH1, sia nel donatore con la stessa variante intronica. Nel gruppo ad alto rischio FDR, abbiamo trovato una sostituzione nella regione promotoriale 5’UTR (-54G>C) già descritta come una variante rara in grado di ridurre l’attività trascrizionale di CDH1, un’altra nella regione vicina al gene in 5’ (-176C>T) con significato ignoto, e una mutazione intronica vicina all’esone 5, IVS4 c.532-18C>T, riportata nella casistica EOGC. Quest’ultima, non ha dimostrato effetti rilevanti nello splicing di CDH1, come la nuova mutazione germinale nella regione intronica a valle dell’esone 1 (IVS1 c.48+7C>T) trovata in un paziente affetto da AMAG. Altre varianti di tipo polimorfico prive di un potenziale effetto sulle funzioni della proteina E-caderina, sono state rilevate nella serie costituita da pazienti con AMAG. Concludendo, i nostri risultati evidenziano che mutazioni germinali a carico del gene CDH1, già descritte come patogenetiche (p.A298T) possono essere rilevate anche in pazienti con GC di tipo sporadico, senza particolare familiarità o non afferenti ai severi criteri descritti per il HDGC. Riportiamo inoltre la scoperta, in un paziente con GC di tipo sporadico, di una nuova mutazione germinale missenso (p.274S) di significato incerto. Inoltre, per la prima volta, sono stati dimostrati un potenziale effetto deleterio nello splicing di CDH1 e una riduzione nell’espressione di E-caderina per la mutazione intronica IVS12 c.1937-13T>C. Il rilevamento della stessa mutazione intronica IVS12, e dell’analogo impatto nello splicing nel donatore sano, ma con un limitato effetto sul livello di mRNA per E-caderina, è interessante e necessita di ulteriori approfondimenti. Estendendo lo screening per il gene CDH1 negli individui a rischio per il GC, abbiamo potuto trovare la mutazione IVS4 c.532-18C>T già descritta nei pazienti EOGC, e la nuova variante intronica IVS1 in un paziente AMAG, sebbene una conseguenza nello splicing non sia stata riscontrata per entrambi i casi. La percentuale complessiva delle mutazioni missenso (67%) nella nostra casistica è predominante rispetto a quella relativa alle mutazioni di tipo non missenso, e ciò suggerisce che l’area del Nord Est d’Italia dovrebbe essere considerata come una zona a medio-alto rischio per l’incidenza delle mutazioni relative a CDH1 e per il rischio di GC. Inoltre, le varianti trovate nei soggetti FDR e nei pazienti AMAG, che sino ad ora erano state descritte solo nei pazienti con carcinoma gastrico, e recenti scoperte di nuove mutazioni in pazienti con GC sporadico, ci incoraggiano a continuare nello screening germinale del gene CDH1 che, insieme ad altri fattori di rischio, potrebbe essere utilizzato per definire un gruppo di pazienti ad alto rischio per GC il quale potrebbe beneficiare di una diagnosi precoce.
Description: 2011/2012
NBN: urn:nbn:it:units-10074
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