Scienze chimiche

La nanotecnologia è chiamata a rivoluzionare molti settori della nostra vita. Tra tutti i campi in cui è convolta, la ricerca delle energie rinnovabili, la possibilità di ottenere acqua pulita in tutte le parti del mondo, il miglioramento della salute e l’aumento dell’aspettativa di vita e lo sviluppo di sistemi informatici, sono gli obiettivi che si distinguono. Le nanostrutture di carbonio sono materiali promettenti che possono aiutare a raggiungere questi obiettivi: includono fullereni, grafene, nanotubi e nanohorns di carbonio. Tutti hanno proprietà interessanti e offrono nuovi vantaggi per le applicazioni in chimica dei materiali e nella medicina. Il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato interessanti metodi per modificare queste nanostrutture per poterli applicare nei campi sopra menzionate. In questo contesto, lo scopo generale di questa tesi è il disegno di sistemi multifunzionali basati su nanostrutture di carbonio destinati ai sensori e alle applicazioni biologiche. Nel capitolo 1, viene fatta una breve panoramica dei nanotubi e i nanohorns di carbonio, spiegando la loro struttura, le loro proprietà e le loro applicazioni. Inoltre, vengono descritte le diverse strategie per la loro funzionalizzazione. Il riconoscimento molecolare gioca un ruolo importante in molti sistemi biologici. In flavoproteine, l'interazione specifica tra il cofattore flavina e l’apoenzima determina la reattività della proteina. Di conseguenza, la modulazione dell'ambiente delle flavine può essere utilizzata come strumento per determinare il loro comportamento e anche per comprendere i processi molecolari negli enzimi. Con questi obiettivi in mente, nel capitolo 2 è descritta la sintesi di differenti derivati basati sul sistema nanotubi di carbonio-triazina per l’uso come ricevitori di riboflavina. In primo luogo, la sintesi e la caratterizzazione di diverse 1,3,5-triazine sono riportate. In una seconda fase, viene descritta la funzionalizzazione di nanotubi di carbonio a parete singola e a parete multipla con le differenti triazine e anche con catene di p-tolil, impiegando le radiazioni microonde. Dopo, si riporta la caratterizzazione completa di questi derivati con varie tecniche. L’auto-assemblaggio degli ibridi è stato analizzato con microscopia elettronica a trasmissione, osservando come i funzionalizzati con 1,3,5-triazine formano buone dispersioni in acqua, mentre loro si auto-assemblano in solventi non polari a causa del riconoscimento di legami d’idrogeno complementari. Tuttavia, derivati funzionalizzati con p-tolil formano migliori dispersioni in solventi organici ed invece si auto-assemblano in acqua. Viene poi studiata la capacità dei nanotubi di carbonio funzionalizzati a parete multipla di riconoscere la riboflavina con la spettroscopia di fluorescenza e ultravioletta visibile, analizzando la grandezza delle interazioni non-covalenti. Si vede come la funzionalizzazione covalente dei nanotubi di carbonio diminuisce la loro capacità di formare interazioni  mentre le interazioni di legame d’idrogeno giocano un ruolo fondamentale nel processo di riconoscimento tra i membri del sistema. Inoltre, si è demostrata l’influenza dei tipi di triazine nel comportamento della riboflavina. In questo modo, è dimostrata la modulazione del riconoscimento molecolare della riboflavina attraverso i diversi nanotubi. Così, recettori artificiali in processi di catalisi possono essere specificamente disegnati per ottenere il controllo delle interazioni tra i nanotubi di carbonio funzionalizzati e la riboflavina, modificando il suo comportamento. Inoltre, le dimensioni e le eccellenti proprietà di nanotubi permettono di utilizzarli come strumento nella progettazione di sensori per la rivelazione di singole molecole. Nel capitolo 3 si riporta la modifica di nanohorn di carbonio per l'impiego come farmaci selettivi nella terapia del cancro è rapportata. Prima, si mostra la sintesi e la caratterizzazione di diversi ibridi di nanohorn: Antibody-CNH, Drug-CNH, Antibody-Drug-CNH e Double Functionalized-CNH. In particolare vengono usati cisplatino, come profarmaco, ed un anticorpo specifico per le cellule che mostrano l’antigene PSMA (Prostate-specific membrane antigen). Di seguito, vengono presentati diversi esperimenti biologici sviluppati in collaborazione con il professor Marco Colombatti dell’Università degli Studi di Verona (Italia). L’ibrido Antibody-Drug-CNH possiede una migliore capacità di uccidere selettivamente le cellule che presentano l'antigene PSMA, rispetto ad altri derivati di nanohorns. Il nuovo sistema progettato offre un grande potenziale dato dalla possibilità di modificare il tipo e il grado di funzionalizzazione. Questo permette di variare la quantità di farmaco o di anticorpo nelle nanostrutture con lo scopo di migliorare l’efficienza dei nuovi derivati. Inoltre, questo metodo può incorporare altri farmaci o anticorpi al sistema, aprendo la porta al trattamento di altre malattie. Il capitolo 4 descrive l'applicazione di diverse nanostrutture di carbonio nella terapia genica. Prima, si mostra la funzionalizzazione di nanohorns di carbonio con gruppi amminici, impiegando diversi metodi che utilizzano le radiazioni a microonde (cicloaddizione 1,3-dipolare e addizione radicalica). In seguito, viene presentato il lavoro svolto in "the Nanomedicine Lab" (Università di Manchester), sotto la supervisione del Prof. Kostas Kostarelos. L'efficacia dei nanohorns di carbonio funzionalizzati per formare complessi con siRNA è comparata con quella dei nanotubi di carbonio forniti dal gruppo del professor Kostarelos. Si è visto come i nanohorn di carbonio formino complessi con siRNA a differenza dei nanotubi. I complessi siRNA/nanohorn si caratterizzano utilizzando varie tecniche e viene analizzata la loro capacità di rilasciare il siRNA. Sebbene nanohorn di carbonio funzionalizzati con l’addizione radicalica mostrano una forte interazione con il materiale genetico, i derivati funzionalizzati con la cicloaddizione 1,3-dipolare lo rilasciano più facilmente. I risultati suggeriscono che, per conseguire il miglior carrier, la complessazione totale del siRNA con le nanostrutture dovrebbe essere evitato. Tuttavia, gli ibridi devono essere analizzati in vitro per garantire la migliore scelta. Questo studio contribuisce alla comprensione dell’uso di nanohorn di carbonio come vettori per terapia genica; ma, un maggior numero di derivati deve essere analizzato per un confronto completo con i nanotubi di carbonio.  

L’obiettivo finale di questa tesi di dottorato è la determinazione di alcune importanti micro e nano caratteristiche strutturali di matrici polimeriche destinate ad applicazioni biomedicali. In particolare, la nostra attenzione si è focalizzata sull’applicazione della Risonanza Magnetica Nucleare a basso campo (LF-NMR), una metodica non distruttiva utilizzata, in particolar modo, nel campo alimentare per la caratterizzazione di sistemi porosi e non. La prima parte di questo lavoro è stata dedicata allo studio di un sistema omogeneo costituito da alginato e pluronico F127. In particolare, grazie alla combinazione della risonanza magnetica ad alto e basso campo, della reologia e del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) è stato possibile capire le caratteristiche strutturali di queste matrici, utilizzate al fine di prevenire la restenosi coronarica. La seconda parte del lavoro è stata dedicata allo studio di sistemi porosi, principalmente utilizzati come scaffold per la medicina rigenerativa e l’ingegneria tissutale. Infatti, la risonanza magnetica nucleare a basso campo è in grado di fornire informazioni sulla dimensione media dei pori, un fattore chiave per la crescita cellulare. Infatti, affinchè le cellule possano crescere all’interno di una matrice polimerica, i pori devono avere delle opportune dimensioni (intorno ai 100 m in diametro). Al fine di verificare la robustezza e affidabilità di questa tecnica, sono stati considerati diversi sistemi: a) green coffee seads, b) gomme stirene/butadiene, c) gel di acido acrilico e cellulosa batterica. Una volta che l'affidabilità del metodo NMR a basso campo è stato definitivamente dimostrato, l'attenzione si è spostata sui sistemi, dal punto di vista biomedico, più interessanti. In particolare, sono state considerati due differenti tipologie di scaffold: a) alginato / idrossiapatite scaffold e b) Poly Left Lactide (PLLA) scaffold. Le prove effettuate sugli scaffold che hanno dato esito positivo sono l’ulteriore conferma della validità della tecnica. Lo studio della proliferazione cellulare all’interno della struttura sembra fattibile ed estremamente interessante, in quanto per la natura non distruttiva dell’analisi sarà probabilmente possibile seguire passo passo la crescita delle cellule nello stesso campione di scaffold a tempi crescenti. Pertanto a conclusione di questo lavoro si può ragionevolmente asserire che l’NMR è uno strumento molto affidabile e che le tecniche da noi riportate sono valide sia per i risultati ottenuti (coerenti a quelli ottenuti con altre tecniche analitiche), sia per la facilità di applicazione a molteplici materiali. Si auspica pertanto che la diffusione nel mondo scientifico e industriale della macchina NMR negli anni a venire sia celere e capillare.

Questa tesi raccoglie i risultati dell’attività di ricerca del mio dottorato che ha riguardato lo studio di molecole sottoposte a fotoionizzazione e il calcolo delle grandezze dinamiche coinvolte in questo tipo di processo. Una prima linea di ricerca ha seguito la descrizione degli effetti di interferenza e diffrazione nei profili di fotoionizzazione ad alte energie, attraverso un approccio basato sul metodo Density Functional Theory (DFT) accoppiato all’uso di una base di B-spline. Le oscillazioni derivanti da questi effetti di interferenza e diffrazione rappresentano un fenomeno universale, presente in tutte le molecole poliatomiche in esame, dalle biatomiche a quelle più complesse non simmetriche, dalla shell di core a quella di valenza più esterna. Nella regione di core abbiamo analizzato le oscillazioni presenti nel rapporto di intensità C2,3/C1,4 nello spettro di fotoelettone C 1s del 2-butino. Nella regione di valenza più interna abbiamo invece preso in esame gli spettri di fotoionizzazione di semplici molecole poliatomiche (propano, butano, isobutano e cis/trans-2-butene) e i risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli sperimentali raccolti presso il sincrotrone Soleil di Parigi. Abbiamo poi analizzato l’effetto dovuto all’emissione coerente da centri equivalenti e quello dovuto alla diffrazione da atomi vicini non equivalenti negli spettri di core e di valenza. Nell’ambito di questa analisi, abbiamo preso in esame acetileni mono e disostituti con fluoro e iodio, comparando i risultati con quelli ottenuti nel caso del più semplice sistema acetilenico. Ci siamo inoltre occupati dello studio di effetti di intereferenza nella ionizzazione di valenza esterna di semplici idrocarburi e, nella stessa regione, abbiamo analizzato come la struttura geometrica di composti permetilati, in particolare la distanza metallo-anello, influenzi i loro profili di fotoionizzazione. Infine, nella regione di valenza interna, sono stati considerati i profili di ionizzazione per il caso di Ar@C60. I risultati sono stati messi a confronto con quelli ottenuti da uno studio precedente sulla molecola di C60. Una seconda linea di ricerca ha invece seguito la descrizione delle osservabili di fotoionizzaione considerando il contributo della correlazione elettronica. Questo può essere fatto attraverso l’implementazione di un formalismo closecoupling dove la funzione del continuo finale è espressa secondo un’espansione analoga a quella Configuration Interaction (CI) per gli stati legati. Il primo livello dell’implementazione ab initio è stato quello di descrivere accuratamente solo la correlazione negli stati legati. A questo scopo, sono stati utilizzati gli orbitali di Dyson. L’uso di questi orbitali è stato applicato alla descrizione delle osservabili di fotoionizzazione nel caso della molecola biatomica CS. Nello spettro di questa molecola è infatti presente un satellite ben risolto dovuto a effetti di correlazione elettronica che non possono essere descritti a livello DFT.

Negli ultimi 50 anni, l’uomo ha attribuito un valore crescente alla ricerca scientifica in quanto strumento di innovazione e di evoluzione tecnologica. La Scienza è diventata uno strumento in grado di migliorare la qualità di vita dell’uomo portando svariate migliorie, ma anche di cambiare radicalmente il suo stile di vita a seguito di scoperte e di strumenti sconosciuti prima di allora. Il progresso tecnologico, la crescita della popolazione mondiale e delle sue esigenze ha causato degli squilibri nel nostro pianeta, dovuti soprattutto and una non omogenea distribuzione delle risorse, in primis quelle energetiche. Dunque, il ruolo della ricerca scientifica contemporanea ha assunto un’ulteriore valenza, quello di appianare gli squilibri sociali ed economici del pianeta. La ricerca di nuove risorse energetiche, o di vettori nei quali conservare l’energia, è uno dei campi scientifici più fertili; in accordo con le ultime tendenze, massima importanza è riposta nelle tecnologie in grado di convertire l’energia solare e renderla disponibile sotto altre forme più pratiche (procedure di storage più semplici) o più facilmente manipolabili. La scelta di sfruttare l’energia solare si basa su alcuni presupposti logici: (i) abbondanza, (ii) distribuzione pressoché uniforme dell’energia solare sulla superficie del pianeta, (iii) esempi disponibili nel mondo naturale che possono essere studiati, compresi, migliorati. La fotosintesi clorofilliana è sicuramente il processo naturale maggiormente conosciuto; perpetrato da una fetta consistente di forme di vita (in particolare del mondo vegetale), permette a queste di sfruttare l’energia contenuta nella radiazione solare e trasformare acqua ed anidride carbonica in carboidrati (la loro riserva di energia) ed ossigeno. Ispirandosi a questo modello, la scienza dei materiali è alla continua ricerca di substrati in grado di trasformare la luce solare in altri vettori energetici a partire da sostanze semplici ed ampliamente disponibili. La scissione dell’acqua in idrogeno ed ossigeno molecolari è uno di questi possibili traguardi; l’acqua è estremamente abbondante sul nostro pianeta (ricoprendone ben il 69% della sua superficie), l’idrogeno è un combustibile che promette di sostituire i derivati del petrolio nel prossimo futuro, e l’ossigeno è di estremo interesse in quanto fonte stessa della vita sul nostro pianeta, almeno nella forma da noi conosciuta. Il progetto di ricerca descritto in questa tesi pone le basi su queste premesse. L’obiettivo prefissato è stato quello di progettare, realizzare, caratterizzare e testare materiali in grado di attuare processi fotosintetici. Durante la fase di progettazione, si è stati costretti a ragionare su quale potesse essere la classe di materiali appropriata a tale scopo, e ci si è orientati verso nano-ibridi organici/inorganici per una serie di motivi: (i) le (nano)-dimensioni avrebbero permesso di lavorare con precursori molecolari e pilotare con maggiore facilità la fase sintetica; (ii) questa classe di materiali possiede generalmente elevate aree superficiali; (iii) l’uso di materiali organici ed inorganici avrebbe permesso di scegliere building blocks che potessero offrire ciascuno le caratteristiche migliori della loro classe di appartenenza. Il lavoro di tesi si è dunque articolato in due sezioni fondamentali: • determinazione di una classe appropriata di cromofori capaci di catturare efficientemente la luce solare ed attivare una specie catalitica ad essi accoppiati. Relativamente a questo punto, scopo non secondario è stato quello di sviluppare nuovi cromofori rispetto a quelli attualmente riportati nella letteratura scientifica e/o sviluppare nuovi protocolli di sintesi capaci di migliorare rese ed efficienza dei processi attualmente noti • scelta di una appropriata specie catalitica e sviluppo dei materiali ibridi contenenti il/i fotosensibilizzanti e il/i catalizzatori; una volta isolata la potenziale diade, si sarebbe proceduto con la fase di monitoraggio dell’attività fotocatalitica del nuovo materiale. Nello sviluppo di questo progetto, i derivati peilenici sono stati scelti quali potenziali fotosensibilizzanti in virtù di una interessante combinazione di caratteristiche elettroniche e chimico-fisiche (approfonditi nel Capitolo 2), ed in particolare ci si è concentrati su composti solubili in acqua. Quest’ultimo dettaglio non è da sottovalutare in quanto, nell’ottica di effettuare i test finali di scissione ossidativa dell’acqua, l’uso di composti idrofilici avrebbe permesso di utilizzare al contempo l’acqua quale reagente e mezzo di reazione. Prima giungere a questa fase, la chimica dei perileni è stata scandagliata a fondo, e vari derivati sono stati isolati e caratterizzati utilizzando protocolli di sintesi sia classici che innovativi (Capitolo 4). La parte centrale del lavoro di tesi ha riguardato lo studio delle diadi costituite da uno dei perileni isolati (PBI2+) e due diversi catalizzatori: (i) Ru4POM, catalizzatore molecolare a base di rutenio, testato per esperimenti sia in fase omogenea che per la realizzazione di un ibrido tri-componente per futuri studi di elettrocatalisi (Capitoli 5-6); (ii) nanoparticelle di ossido di iridio per la preparazione di fotoanodi da applicare in celle fotoelettrochimiche (Capitolo 7). La confidenza acquisita coi derivati perilenici ha permesso di sviluppare anche progetti paralleli che non riguardassero applicazioni in ambito energetico; un dettagliato studio di perileni bisimmidi quali SERS markers è trattato nella parte finale di questa tesi (Capitolo 8).

La cute è uno degli organi più estesi del corpo umano e gioca un importante ruolo nella regolazione dell’idratazione corporea, ha proprietà sensoriali, funzioni strutturali e agisce come prima barriera contro gli agenti esterni (Blank et al, 1984). Può costituire un’importante via di uptake per molte sostanze. L’assorbimento percutaneo è stato oggetto di studio in numerosi lavori fin dallo scorso secolo, ma ha recentemente riscosso nuovo interesse a causa dell’ascesa del “mondo delle nanoparticelle”. L’esposizione umana alle nanoparticelle può avvenire sia per cause antropiche che naturali. Dal momento che le nanoparticelle hanno dimensioni compatibili con quelle della via cutanea è importante valutare la possibilità di uptake in scenari di esposizioni reali. Le nanoparticelle di argento (AgNPs) sono sempre più spesso applicate a un’ ampia gamma di materiali a scopo biomedico, proprio perchè sono in grado di rilasciare una considerevole quantità di ioni argento che sono responsabili di un’attività antibatterica ad ampio spettro. Questi materiali nanoparticellati sono solitamente applicati a diretto contatto con la cute umana, nella maggior parte dei casi a cute lesa con una ridotta capacità di agire da barriera. Soprattuto nel caso della cute lesa, questo tipo di esposizione potrebbe portare a un incremento dell’uptake sistemico di argento con potenziali effetti collaterali. I principali obiettivi di questa tesi sono dunque: (i) valutare la permeazione dell’argento da parte di differenti materiali al nanoargento, simulando scenari di esposizione che siano il più possible realistici; (ii) definire i fattori sperimentali che potrebbero influenzare i risultati degli esperimenti in vitro, come ad esempio la metodologia di conservazione della cute; (iii) l’ottimizzazione dei metodi analitici per la quantificazione dell’argento in diverse matrici biologiche. E’ noto dalla letteratura che l’argento sia in grado di permeare la cute, sia intatta che lesa; d’altra parte, non sono disponibili dati riguardo alla permeazione dell’argento attraverso le più comuni tipologie di cute utilizzate come impianti per la cura di ustioni gravi. Petanto in questa tesi la permeazione dell’argento è stata valutata, attraverso il metodo delle Celle a Diffusione di Franz, esponendo campioni di cute fresca, cute crioconservata e cute glicerolata a una sospensione di AgNPs in sudore sintetico per 24 ore. Studiando i profili della permeazione dell’argento nel tempo, risulta evidente una maggiore permeazione attraverso cute glicerolata: il flusso di permeazione dell’argento a 24-h è di 0.2 ng cm-2 h-1 (lag time: 8.2 h) per la cute fresca, 0.3 ng cm cm-2 h-1 (lag time: 10.9 h) per la crioconservata, e 3.8 ng cm-2 h-1 (lag time: 6.3 h) per la glicerolata. La permeazione attraverso cute glicerolata è significativamente più alta sia rispetto alla cute fresca che a quella crioconservata. Questo risultato potrebbe avere delle importanti implicazioni cliniche per il trattamento delle ustioni con prodotti al nanoargento. Un ulteriore importante risultato è che la permeazione attraverso cute crioconservata non differisce significativamente da quella fresca. Ciò giustifica l’utilizzo di cute crioconservata nel caso di esperimenti in vitro. Una volta valutata la permeazione cutanea attraverso i diversi modelli di cute e determinato quindi il modello più idoneo per gli studi in vitro, il secondo obiettivo di questa tesi è quello di caratterizzare il rilascio di argento da parte di alcuni tessuti al nanoargento, disponibili in commercio, e determinare l’assorbimento percutaneo in vitro dell’argento da essi rilasciato. E’ stato effettuato uno screening preliminare di otto diversi tessuti all’argento in modo da scegliere, per successivi studi, materiali che fossero in grado di rilasciare un quantitativo elevato di argento e il cui utilizzo avesse una certa rilevanza sul piano sociale. I tessuti selezionati sono stati due diverse garze per la cura di cute lesa (ustioni o tagli) e un pigiama ideato per bambini affetti da Dermatite Atopica. L’assorbimento percutaneo in vitro è stato determinato immergendo 3 pezzi di ciascun materiale nel sudore sintetico contenuto nelle celle donatrici di Franz. La caratterizzazione dell’argento presente nei tessuti è stata effettuata mediante Scanning Electron Microscopy with integrated Energy Dispersive X-Ray spectroscopy (SEM-EDX) e Atomic Force Microscopy (AFM). La concentrazione dell’argento nelle soluzioni donatrici e nella cuteè stata determinate mediante un Electro Thermal Atomic Absorption Spectrometer (ET-AAS) e un Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (ICP-MS). Tutti i tessuti analizzati contenevano AgNPs di diverse dimensioni e morfologia e, in seguito all’immersione in sudore, è stata rilevata la presenza di clusters di AgCl sulla superficie delle fibre. Le concentrazioni di argento in sudore sintetico raggiungevano tra i 21 e i 104 µg/g (w/w). Sono stati inoltre rilevati microaggregati di Ag e di AgCl sia nell’epidermide che nel derma utilizzati per l’esperimento. Le dimensioni di questi aggregati suggerisce che la loro formazione avvenga a causa di fenomeni di precipitazione proprio tra gli strati cutanei. Inoltre, il fatto che l’argento sia stato trovato anche negli strati più interni della cute vascolarizzata (derma) suggerisce la possibilità di assorbimento sistemico dell’argento permeato. Alla luce di questi risultati sarebbe quindi opportuno valutare anche l’esposizione ripetuta e prolungata nel tempo. Poiché non sono state rilevate significative differenze tra i tre materiali testati, il pigiama al nanoargento è stato selezionato per la successiva stperimentazione in vivo. I dati riguardanti l’uptake in vivo dell’argento in seguito a esposizione cutanea sono limitati, in parte a causa della mancanza di metodi analitici adeguati per la determinazione dell’argento in matrice biologica. Un ulteriore obiettivo di questa tesi è dunque lo sviluppo di un metodo analitico per la quantificazione dell’uptake in vivo su soggetti che abbiano indossato il tessuto al nanoargento. Campioni dello strato più esterno dell’epidermide (Stratum Corneum, SC) sono stati prelevati, mediante tapes adesivi, da volontari che avevano indossato il tessuto al nanoargento secondo scenari realistici. Diverse tipologie di estrazione dell’argento dai tapes adesivi sono state confrontate; le soluzioni estraenti sono state analizzate per la quantificazione dell’argento mediante ICP-MS. Il metodo descritto in questa tesi ha come limite di detezione (LOD) 2 ng di Ag per campione di SC. Il metodo permette di misurare la concentrazione di Ag a diversi spessori di SC permettendo di ricavare le cinetiche di permeazione dell’argento. La sensibilità del metodo permette inoltre di determinare la concentrazione dell’argento in ultra trace nelle urine dei soggetti prima e dopo l’esposizione cutanea (LOD=0.010 µg Ag / L in urina). Il metodo sopra descritto è stato quindi applicator per determinare l’assorbimento percutaneo in vivo in seguito a ripetuta esposizione di soggetti sani e di pazienti affetti da dermatite atopica. Inoltre, è stato valutato l’effetto infiammatorio dell’argento permeate nella cute. Soggetti sani (n=15) e pazienti affetti da una lieve forma di dermatite atopica (n=15) hanno indossato una manica di tessuto contenente il 3.6% di argento, su di un avambraccio, e, sull’altro, un tessuto placebo (senza argento) per le 8 ore notturne, per 5 giorni consecutivi. La permeazione dell’argento è stata valutata analizzando l’andamento della concentrazione in funzione della profondità di SC prelevato dall’avambraccio, dopo la prima e la quinta esposizione. Inoltre, I campioni di SC sono stati analizzati mediante SEM-EDX e AFM per valutare la presenza di aggregati o nanoparticelle di argento eventualmente penetrate. L’uptake sistemico è stato verificato determinando la conentrazione di Ag nelle urine raccolte prima e dopo i cinque giorni di esposizione. Il quadro infiammatorio è stato valutato comparando i livelli di interleuchine IL-1α e IL-1RA nella cute tra siti esposti e non esposti dopo i 5 giorni di esposizione. L’argento è stato quantificato con i metodi descritti in precedenza. Il flusso di argento attraverso lo SC al raggiungimento dello stato stazionario in soggetti sani e nei pazienti era rispettivamente di 2.3 (1.2-3.8) e 2.0 (0.8-4.1) *10-6 mg Ag/cm2/h. Sui tape strips campionati dagli avambracci esposti all’argento, sono stati trovati aggregati di argento in un ampio range dimensionale. Il SEM-EDX ha rilevato la presenza di aggregati nel range 150-2000 nm in tutti i campioni prelevati, con un numero descrescente partendo dagli strati cutanei più esterni a quelli più interni. L’AFM ha confermato la presenza di questi aggregati e ha inoltre evidenziato le differenze strutturali tra i soggetti sani e quelli affetti da dermatite atopica. Non è stato riscontrato argento nei campioni derivanti dalla cute esposta al placebo. L’EDX ha rivelato che alcuni aggregate di argento contenevano inoltre zolfo e cloro. I livelli urinari di argento non hanno subito variazioni significative in seguito all’esposizione né nei casi né nei controlli. Infine non sono state riscontrate differenze nei livelli di interleuchine in seguito all’esposizione al tessuto contenente nanoargento. La presenza di aggregati con dimensioni sub-micrometriche è probabilmente dovuta a una precipitazione in vivo di ioni argento permeati attraverso lo SC e all’ aggregazione delle nanoparticelle permeate. La presenza di zolfo negli aggregati è probabilmente dovuta alla chelazione dell’argento da parte dei tioli delle proteine nello SC. L’AFM ha inoltre mostrato la presenza di un sottile strato lipidico sulla superficie degli aggregati suggerendo una penetrazione attraverso gli spazi intercellulari. L’interazione dell’Ag con le proteine dello SC e la formazione di aggregati potrebbe facilitare la creazione di una riserva di ioni Ag+ negli starti cutanei. Gli aggregati potrebbero lentamente rilasciare Ag, rendendo l’esposizione effettiva più lunga. D’altra parte, la misura degli aggregati è troppo grande perchè possano ulteriormente diffondere e potrebbero venire rimossi dai normali processi di desquamazione; perciò la formazione degli aggregati potrebbe anche essere svantaggiosa per un ulteriore assorbimento di Ag. I dati riguardanti l’assorbimento percutaneo in vivo e l’escrezione urinaria di Ag mostrano che il quantitativo di argento assorbito per via cutanea (secondo questo scenario di esposizione) è inferiore alla dose di riferimento corrente proposta dall’ US Environmental Protection Agency (EPA). Inoltre, l’esposizione cutanea al tessuto contenente nanoargento non ah alterato il quadro infiammatorio delle citokine nella cute. In questa tesi è stata testata un’ esposizione che non supera i 5 giorni consecutivi. I dati ottenuti secondo questo scenario espositivo hanno rivelato che l’assorbimento cutaneo dopo aver indossato il tessuto in esame è basso e non dovrebbe realisticamente portare a tossicità a livello sistemico. D’altra parte questi risultati evidenziano la necessità di valutare sia gli effetti sistemici in seguito a un’esposizione più prolongata nel tempo, soprattutto in soggetti con cute danneggiata, sia il destino nel tempo delle forme di argento trattenute nella cute.