Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10077/9975
Title: Nanoscale platform to study unstructured proteins interactions
Authors: Corvaglia, Stefania
Supervisore/Tutore: Scaini, Denis
Cosupervisore: Casalis, Loredana
Issue Date: 27-Mar-2014
Publisher: Università degli studi di Trieste
Abstract: Le proteine intrinsecamente disordinate (IDP), nello stato nativo non ripiegate, sono inclini all’aggregazione e direttamente correlate con lo sviluppo di malattie amiloidi. Tra queste, ci siamo focalizzati sullo studio dell’alfa-Sinucleina (AS), una proteina coinvolta nella malattia di Parkinson, un disturbo neurodegenerativo caratterizzato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici e l’accumulo di AS in placche amiloidi. Sebbene lo studio delle interazioni AS-dopamina sia di importanza cruciale nella comprensione dei meccanismi responsabili dello sviluppo della malattia, tuttavia, non sono disponibili dati in letteratura riguardo all’affinità di questo legame nei diversi stati ripiegati/funzionali dell’AS. L’elevata tendenza all’aggregazione delle IDP rende difficile il loro studio in soluzione e anche una stima approssimativa dei parametri relativi all’affinità di legame è estremamente difficile. Nuove tecniche di superficie potrebbero pertanto permettere lo studio delle interazioni di legame di molecole e di farmaci capaci di favorire/inibire l’aggregazione. In particolare, le tecniche di superficie potrebbero permettere un migliore controllo dell’immobilizzazione di queste proteine, particolarmente instabili in soluzione, e di studiare con alta precisione fenomeni di legame. Con questa visione, la microscopia di forza atomica (AFM) rappresenta un’opportunità. Il nanografting, una tecnica litografica per mezzo AFM, permette l’immobilizzazione di proteine orientate con il preciso controllo dei parametri di immobilizzazione. Con AFM e AFM-nanografting, abbiamo prodotto una nuova piattaforma per lo studio di diversi aspetti dell’aggregazione/interazione dell’AS. Abbiamo quindi studiato l’affinità di legame tra AS e dopamina misurando variazioni nell’altezza e nella rugosità della topografia AFM su AS immobilizzata in aree confinate, in funzione della concentrazione di dopamina. Il valore micromolare della costante di dissociazione (Kd) è stato inoltre confermato dallo studio dello spiazzamento di un anticorpo legato all’AS in seguito all’aggiunta di dopamina. Sebbene la Kd calcolata con il nostro approccio sia una stima della reale Kd calcolata in soluzione, in quanto influenzata dall’affollamento delle molecole o ai limiti di diffusione, i nostri risultati sono comunque degni di nota. Infine, abbiamo testato il nostro saggio per lo studio delle fasi preliminari dell’aggregazione dell’AS. In particolare, abbiamo osservato come aggregati confinati di AS siano disciolti dall’azione della dopamina, confermando il suo ruolo nell’inibizione della fibrillazione. In questo modo, abbiamo creato un saggio potenzialmente utilizzabile per lo screening di nuove molecole che interagiscono con l’AS ed eventualmente utilizzabili come farmaci. Inoltre, l’interazione di AS con microdomini della membrana cellulare (lipid rafts) sono oggetto di dibattito. Per questo motivo, abbiamo utilizzato dei doppi strati lipidici modello con composizione capace di mimare quella dei lipid rafts. In particolare, abbiamo caratterizzato con AFM e GISAXS (Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering) delle membrane lipidiche di tre componenti, aventi separazione di fase lipidica, studiando l’effetto dell’umidità e della percentuale di colesterolo su ciascuna fase. Abbiamo quindi studiato l’effetto del legame dell’AS su questo sistema modello. In particolare, immagini di topografia AFM in liquido ci hanno dato la possibilità di discriminare la topografia di strutture filamentose formatesi inseguito all’interazione di AS. Il fenomeno, dipendente dalla fase lipidica della membrana e quindi dall’ordine delle molecole, sembra essere favorito da un blando impacchettamento dei lipidi. Inoltre, utilizzando misure GISAXS, è stato possibile determinare un considerevole riordinamento della membrana in seguito al legame di AS.
Intrinsically disordered proteins (IDPs) are natively unfolded, prone to aggregation and directly correlated with amyloid diseases. Among them, we focused on alpha-Synuclein (AS), a protein related to Parkinson’s disease, a neurogenerative disorder characterized by the degeneration of dopaminergic neurons and the accumulation of AS into amyloid plaques. In particular, the study of AS-dopamine (DA) adducts is crucial for the comprehension of the mechanisms responsible of Parkinson’s disease development. However, according to our knowledge, there is no evidence in literature about AS-DA binding parameters at different folding/functional state of AS. IDPs have in fact a strong propensity to aggregate, making it extremely difficult to get even rough estimation of binding affinities in solution. Therefore, new methods able to study surface immobilized IDPs could be useful for both fundamental studies of binding interactions and drug screening of new compounds able to interact favouring/inhibiting the aggregation process. In particular, the use of a surface-based technique could help to better control the immobilization of such proteins, particularly unstable in solution, and to study with high precision binding events. With this perspective, atomic force microscopy (AFM) offers a challenge. Nanografting, an AFM mediated nanolithographic technique, allows for the nanoscale immobilization of proteins in a well-oriented manner with the precise control of the immobilization parameters. By means of AFM and AFM-nanografting, we produced a new platform able to study different aspects of AS aggregation/interactions. First, we studied AS-dopamine binding affinity by measuring the variation of AFM topographic height on AS nanopatches due to binding of DA on the patch as a function of its concentration in solution, and the correspondent surface roughness variation. The value of the dissociation constant, in the micromolar range, was confirmed by studying the displacement of AS-bound mAbs, after the addition of dopamine. We think that this result is noteworthy, even though we are aware that the Kd values obtained with our assay are probably a very rough estimate of the Kd of the AS/DA interaction occurring in solution, due for instance to AS surface crowding and restrictions to diffusion. Finally, the assay was used to study the early stages of the aggregation process. In particular, dopamine dissolved confined AS aggregates confirming its role in the inhibition of fibrillation. In this way, we created a potential screening assay able to study the interaction of AS with new molecules virtually usable as new drugs. Moreover, the interaction of AS with lipid rafts, specialized microdomains of the cell membrane, is object of a strong debate. For this reason, we created a model supported lipid bilayer with composition able to mimic lipid rafts. In particular, we characterized by both AFM and Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering (GISAXS) a three components membrane presenting a lipid phase separation, focusing on the effect of humidity and cholesterol percentage on the structure of each phase. Then, we studied the effect of AS binding on this membrane model system. In particular, trough AFM imaging in liquid we discriminated the topology of filamentous structures resulting from AS binding. The phenomenon is dependent on the membrane’s lipid phase and order and is favoured by mild packing of lipids. From GISAXS measurements, the occurrence of a strong rearrangement of the membrane upon AS binding was suggested.
Ciclo di dottorato: XXVI Ciclo
metadata.dc.subject.classification: SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NANOTECNOLOGIE
Description: 2012/2013
Keywords: alpha-sinucleina
biofisica
AFM
Alpha-synuclein
biophysics
Language: en
Type: Doctoral Thesis
Settore scientifico-disciplinare: FIS/03 FISICA DELLA MATERIA
NBN: urn:nbn:it:units-12259
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